Zwiększony obrót DC do węzłów chłonnych i nadwrażliwość kontaktowa w myszach z niedoborem cząsteczki adhezyjnej A z adhezją ad 8

Królik JAM-B był prezentem Steve a Rosena (University of California, San Francisco, California, USA). Immunoprecypitację i Western blot na ekstraktach komórkowych przeprowadzono w sposób opisany uprzednio. Obciążenie immunologiczne i DC. Nerek myszy, aorty i węzłów chłonnych usunięto, zatopiono w związku OCT Tissue-Tek (Miles Inc.), szybko zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Zamrożone tkanki następnie dzielono na sekcje o długości 5 urn, utrwalano metanolem przez 10 minut w. 20 ° C i barwiono mAb anty-PECAM Mec 13.3 (37) i mAb anty-JAM-A BV12 (1), a następnie Sprzężone z FITC lub Cy3 osiołowe przeciwciała przeciwko szczurom (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Zamrożone węzły chłonne utrwalono w acetonie przez 10 minut w temperaturze ~ 20 ° C i podwójnie wybarwiono szczurzym anty-mysim JAM-A (BV12) i króliczym anty-mysim LYVE przez noc w temperaturze 4 ° C, a następnie Cy3 osiołkiem przeciw szczurzym i FITC. kozie przeciwciała anty-królicze (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Obrazy fluorescencyjne tkanek barwionych immunologicznie analizowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Leica DMR, a obrazy rejestrowano za pomocą kamery Hamamatsu 3CCD przed obróbką z Adobe Photoshop dla Macintosh. Cienkie wycinki tkanek z węzłów chłonnych uzyskano i wybarwiono H & E do oceny morfologicznej. Dla immunofluorescencji i immunohistochemii z zastosowaniem pośredniej techniki immunoperoksydazy, węzły chłonne i małe fragmenty mysich uszu osadzono i zamrożono w związku OCT Tissue-Tek. Przekroje trój-mikronowe wysuszono na powietrzu przez noc, utrwalono w acetonie przez 10 minut i inkubowano z 10% normalną surowicą króliczą. Skrawki następnie inkubowano z różnymi pierwszorzędowymi Ab, w tym szczurzymi anty-mysimi JAM-A (BV12), anty-MHC klasy II (klon 2G9, BD Biosciences. Pharmingen) i anty-Langerin (miły dar G. Trinchieri, Schering-Plough Corp., Dardilly, Francja). Pierwotne Ab zostały ujawnione z anty-szczurzymi biotynylowanymi drugorzędowymi Ab. S (Vector Laboratories Inc.), a następnie Texas z czerwonym. lub streptawidyna sprzężona z FITC. Preparaty umieszczono w 90% glicerolu i analizowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Olympus BX60. Ilościową analizę naskórkowych LC eksprymujących MHC klasy II przeprowadzono przez ocenę 30 pól o dużej mocy (powiększenie x 400) uzyskanych z niesekwencyjnych sekcji ucha. Liczby LC określono przez zliczenie komórek pozytywnych względem MHC klasy II z rozpoznawalną morfologią gwiaździstą i normalizacją liczby podstawowych keratynocytów; dane wyrażono jako średnią liczbę LC / 100 keratynocytów (41). Cytokiny. Ludzkie CCL3 i CCL19 pochodziły z PeproTech Inc. Mysz GM-CSF pochodziła od Sandoz Inc. Murine TNF-a. był życzliwym prezentem od P. Vandenabeele (Gent University, Belgia). Ligand ludzkiego Flt3 był hojnym podarkiem od Immunex Corp. Cytokiny były wolne od endotoksyn jak oceniono za pomocą testu limbocytów amebocytów (BioWhittaker Inc.). Testy chemotaksji i transmigracji. Eksperymenty migracji chemotaksji i transeptotelium przeprowadzono w poliwęglanowych wkładkach Transwell (por 5. M, Corning Costar Corp.), jak opisano wcześniej (40), z niewielkimi modyfikacjami. Oznaczone 51Cr DC (15 x 104 / studzienkę w 0,1 ml dla chemotaksji i 5 x 104 / studzienkę w 0,1 ml dla transmigracji) zaszczepiono w górnym przedziale i chemoatraktanty umieszczono w dolnym przedziale. Po 90 minutach inkubacji w 37 ° C oceniano radioaktywność obecną w niższym przedziale. Chemokiny zastosowano w optymalnym stężeniu 100 ng / ml. Wyniki podaje się jako procent wkładu, jak w poniższym wzorze: (cpm w dolnym przedziale / cpm wejścia) x 100. W eksperymentach transmigracyjnych, MELC (38) lub mikronaczyniowa mysia linia komórek śródbłonka 1G11 (40) były hodowane jako monowarstw na wstawkach powleczonych żelatyną lub fibronektyną; wyznakowane DC nałożono na monowarstwy. W niektórych eksperymentach MELC hodowano na górnej lub dolnej stronie filtra. Test ścieżki fagokinetycznej. Test przeprowadzono zgodnie z opisem (42). W skrócie, komórki umieszczono na szklanych szkiełkach nakrywkowych uprzednio pokrytych koloidalnym złotem i inkubowano przez 24 godziny w 37 ° C. Następnie komórki utrwalono 3% paraformaldehydem i obserwowano przez mikroskopię świetlną. Zdjęcia poszczególnych komórek analizowano za pomocą oprogramowania NIH Image do pomiaru obszaru wolnego od cząstek i liczenia liczby ścieżek wytwarzanych przez każdą komórkę. W niektórych eksperymentach BM-DC z myszy Jam-A + / + inkubowano podczas testu ścieżki z mAb anty-JAM-A BV11 (1, 9) i mAb anty-PECAM Mec 13.3 (37) jako kontrola negatywna (20 .g / ml). Malowanie skóry FITC. Liczbę DC węzłów chłonnych po malowaniu skóry FITC analizowano jak opisano wcześniej (43). W skrócie, FITC (Sigma-Aldrich) rozpuszczono (5 mg / ml) w mieszaninie 50:50 (obj./obj.) Aceton-dibutyloftalan tuż przed nałożeniem
[podobne: makijaz permanentny cena, szczepienie dur brzuszny, jak radzić sobie po rozstaniu ]
[podobne: dlaczego ziewanie jest zaraźliwe, bytovia bytów, rezonans magnetyczny otwarty warszawa ]
[więcej w: dlaczego ziewanie jest zaraźliwe, bytovia bytów, rezonans magnetyczny otwarty warszawa ]