Wydalanie ludzkiej mitochondrialnej deformylazy peptydowej, nowy cel antyrakowy antybiotyków na bazie aktynoniny czesc 4

Kontrolne siRNA (niespecyficzne dupleksy) nie miały wpływu na poziomy mRNA, ekspresję białka ani proliferację. Skierowane na cel siRNA nie zmniejszały ekspresji kontroli białka fluorescencyjnego (dane nie pokazane). Analiza kinetyczna wykazała, że znaczny spadek zarówno ekspresji białka, jak i proliferacji komórek nie został zaobserwowany przed upływem 48 godzin po transfekcji, zgodnie z wymogiem katabolizmu wstępnie uformowanego białka, aby obserwować funkcjonalne efekty wyciszania genu. Sekwencje siRNA, które wykazywały znaczące hamowanie proliferacji komórkowej, kierowały region między zasadami 580 i 680. Kilka nieskutecznych sekwencji siRNA skierowano na inne regiony mRNA, zgodnie z ogólną obserwacją, że siRNA jest skuteczne dla niektórych, ale nie wszystkich sekwencji w obrębie wiadomości. Figura 5siRNA zaprojektowana do ukierunkowania na hamowanie ekspresji białka HsPDF i proliferację komórek nowotworowych. (A) siRNA zostały zaprojektowane do ukierunkowania na HsPDF. Sekwencje 2 siRNA, które były skuteczne, to HsPDF 581. 601 i HsPDF 659. 679. Liczby odnoszą się do liczby nukleotydowej w stosunku do kodonu start ludzkiego mRNA Pdf. (B) Komórki HeLa trwale eksprymujące białko fuzyjne HsPDF-YFP transfekowano 100 nM kontrolnych lub specyficznych dla HsPDF siRNA. Średnia szczytowa fluorescencja określona 48 godzin po transfekcji pokazuje, że specyficzne dla celu siRNA znacząco zmniejszają ekspresję białka (* P <0,001). (C) Komórki HeLa transfekowano 100 nM kontrolnych siRNA specyficznych dla HsPDF. Proliferację komórek określono przez wbudowanie trytowanej tymidyny przez okres 3 dni po transfekcji. Grupa kontrolna siRNA (wypełnione kółka) nie wykazywała istotnych zmian (P> 0,05) w proliferacji komórek w porównaniu z grupą kontrolną bez siRNA (puste kółka). siRNA HsPDF 581. 601 (pionowe trójkąty) i siRNA HsPDF 659. 679 (odwrócone trójkąty) powodowały znaczące spadki (** P <0,05) w proliferacji komórek i 2 dni po transfekcji. (D) Komórki HeLa transfekowano 10, 20, 50 i 100 nM kontrolnych siRNA specyficznych dla HsPDF. Proliferację komórek określono przez wbudowanie trytowanej tymidyny 2 dni po transfekcji. SiRNA specyficzne dla HsPDF znacząco hamowały proliferację komórek (* P <0,001) we wszystkich 4 dawkach w porównaniu z grupą bez siRNA i odpowiednią dawką kontrolnego siRNA, podczas gdy istotne hamowanie (P <0,001) było obserwowane tylko w wyższym stężeniu. dawki (50 i 100 nM) grupy kontrolnej. Aby rozwiać obawy dotyczące wpływu poza-celowego i zależnego od stężenia na ekspresję genów ssaków (27-29), przetestowaliśmy także zakres dawek dla naszych skutecznych siRNA. Doniesiono, że charakterystyczną cechą niespecyficznego wpływu na ekspresję genów jest zależność od stężenia siRNA i że niespecyficzne efekty występują przy stężeniach siRNA 100 nM, ale nie przy 20 nM (29). Stwierdziliśmy, że 2 skuteczne siRNA były zdolne do znacznego hamowania proliferacji komórek nowotworowych w dawce tak niskiej jak 10 nM (Figura 5D), która jest znacznie niższa od stężenia dla niespecyficznych skutków opisanych w literaturze. Co więcej, efekt zależny od stężenia występował tylko w przypadku siRNA kontrolnego, a nie w siRNA specyficznych dla celu. Dane te potwierdzają, że HsPDF jest ważny dla wzrostu i przeżycia komórek rakowych. Tak więc, antyproliferacyjne działanie aktynoniny i licznych analogów na szerokiej gamie ludzkich linii komórek nowotworowych, w połączeniu z wymaganiem HsPDF do wzrostu komórek, dostarczają przekonujących dowodów, że HsPDF jest kluczowym celem aktynominy i że hamowanie tego białka w mitochondria prowadzą do śmierci komórki w komórkach nowotworowych. Actinonin powoduje selektywną depolaryzację błony mitochondrialnej. Dowody, że aktynonina działa na HsPDF, mitochondrialne białko, sugeruje, że aktynonina może pośredniczyć w jej antyproliferacyjnym działaniu poprzez zakłócenie funkcji mitochondriów. Kluczowym wczesnym wskaźnikiem toksyczności mitochondrialnej jest utrata potencjału przez błonę mitochondrialną (30). Monitorowaliśmy potencjał błonowy mitochondriów za pomocą barwnika fluorescencyjnego JC-1 (opisanego w Methods), który wykazuje akumulację zależną od potencjału błonowego w mitochondriach. JC-1 emituje przy 525 nm (zielony) w postaci monomerycznej; w obecności wysokiego potencjału błonowego mitochondrialnego, JC-1 tworzy czerwone (590 nm) fluorescencyjne agregaty. Zatem depolaryzację mitochondrialną można ocenić ilościowo przez zmniejszenie stosunku intensywności fluorescencji czerwonego / zielonego. Pokazujemy, że traktowanie aktynoniną komórek RL (linia komórek ludzkiego chłoniaka z limfocytów B) powoduje znaczącą zależną od czasu i dawki depolaryzację błony mitochondrialnej (Figura 6) [więcej w: jak radzić sobie po rozstaniu, zielone koktajle przepisy, dlaczego ziewanie jest zaraźliwe ] [patrz też: leczenie zębów w narkozie, szpital powiatowy mikołów, porozumienie rodzicielskie wzór ] [podobne: leczenie zębów w narkozie, szpital powiatowy mikołów, porozumienie rodzicielskie wzór ]