Wydalanie ludzkiej mitochondrialnej deformylazy peptydowej, nowy cel antyrakowy antybiotyków na bazie aktynoniny cd

Jako kontrolę oznaczono YFP jako N-końcowy mutant skrótu HsPDF, który nie posiada mitochondrialnej sekwencji sygnałowej. Skrócone białko fuzyjne HsPDF-YFP nie zdołało przeprowadzić kolokalizacji z markerem mitochondrialnym, a zamiast tego było homogenicznie rozprowadzone w cytozolu i nukleoplazmie, co jest nie do odróżnienia od samego ekspresji YFP. Figura 3 N-koniec kieruje HsPDF do mitochondriów. Komórki HeLa transfekowano HsPDF o pełnej długości lub skróconym końcem N (AA 643 244) znakowanym na C-końcu za pomocą YFP i obrazowano żywcem za pomocą laserowej mikroskopii konfokalnej 24 godziny po transfekcji i 30 minut po dodaniu MitoTracker Red CMXRos do media. Pasek skali: 10 .m. Actinonin hamuje wzrost komórek w różnych ludzkich liniach komórek nowotworowych. Wcześniej wykazaliśmy, że aktynonina wywiera działanie antyproliferacyjne zarówno na komórki białaczki HL60, jak i na komórki chłoniaka Daudi, i że aktywność antyproliferacyjna nie koreluje z ekspresją APN. Dlatego postawiliśmy hipotezę, że HsPDF jest celem aktynominy w komórkach nowotworowych. Ponieważ HsPDF ulega ekspresji w różnych tkankach ludzkich (10, 26), badaliśmy, czy aktynonina hamuje wzrost i proliferację różnych ludzkich linii komórek nowotworowych. Actinonina wykazywała działanie antyproliferacyjne wobec 16 z 17 badanych ludzkich linii komórek nowotworowych, reprezentujących 9 różnych linii komórkowych (tabela 2). Tylko komórki nerkowe HEK293 były oporne. Dla porównania liczba. Normalna. stwierdzono również, że linie komórkowe są oporne na aktynomoninę. Były to linie komórkowe WI-38 i NIH-3T3 (odpowiednio ludzkie i mysie normalne linie komórkowe fibroblastów) i normalne ludzkie PBMC (hPBMC). Linia komórkowa fibroblastów myszy AL67 wrażliwa na aktynoninę różni się od komórek macierzystych NIH-3T3 tym, że została przekształcona przez ras. Wcześniej informowaliśmy, że aktynonina może mieć pewne działania mielosupresyjne, o czym świadczy zmniejszone tworzenie kolonii ludzkich komórek szpiku kostnego (20). Jednakże, dawka wymagana do 50% zahamowania wzrostu tych normalnych komórek była ponad 5-krotna niż wartość IC50 wymagana dla badanych tutaj linii komórek krwiotwórczych hematopoetycznych. Tabela 2 Antyproliferacyjne działanie aktynoniny na panel linii komórek ludzkich i mysich Analogi aktynoniny ujawniają związek między hamowaniem HsPDF a aktywnością antyproliferacyjną. Zsyntetyzowano trzydzieści trzy analogi aktynoniny, aby ustalić, czy istnieje korelacja pomiędzy hamowaniem aktywności HsPDF a wzrostem ludzkich komórek nowotworowych i znalezieniem silniejszych i specyficznych związków. Przeanalizowaliśmy aktynoninę i jej analogi pod kątem hamowania zarówno enzymu HsPDF, jak i hamowania wzrostu komórek nowotworowych człowieka, mierzonego przez metabolizm XTT (sól tetrazoliowa) i wbudowywanie trytowanej tymidyny (Tabela 3 i Figura 4). Linie komórkowe użyte do badania obejmowały CWR22Rv1 i TSU-PRI (ludzki rak prostaty), Daudi (ludzki chłoniak Burkitta) i HL60 (ludzka ostra białaczka szpikowa). Dwie linie komórkowe raka gruczołu krokowego (negatywne pod względem APN) wybrano jako reprezentatywne linie komórek guza litego, z charakterystykami oporności na androgeny i bez nich. Ponieważ aktynonina może również hamować APN, wybrano 2 krwiotwórcze linie komórkowe, z i bez ekspresji APN. Wszystkie 9 związków, które hamowały HsPDF z IC50 mniejszym niż 0,1 .M, były również silnymi antyproliferatami (IC50 <50 .M na co najmniej linii komórkowej). Spośród 16 związków, które hamowały HsPDF o IC50 0,2. M lub mniej, wszystkie były również antyproliferacyjne. Ponadto, 6 z 7 związków bez mierzalnego hamowania HsPDF nie wykazywało hamowania wzrostu komórek. Dane te pokazują, że hamowanie HsPDF jest konsekwentnie związane z działaniem antyproliferacyjnym przeciw komórkom guza ludzkiego. Odwrotnie, brak aktywności przeciwko HsPDF jest ogólnie związany z niezdolnością do hamowania wzrostu komórek nowotworowych. Obserwacja, że 9 związków wykazujących słabe hamowanie HsPDF było antyproliferacyjne sugeruje, że związki te hamują wzrost komórek poprzez mechanizmy niezależne od HsPDF. Figura 4 Struktury chemiczne aktynoniny i wybrane analogi o najniższym IC50 przeciwko HsPDF (patrz Tabela 3). Tabela 3 Wpływ (IC50) aktynoniny i jej analogów na ludzkie linie komórek nowotworowych i aktywność HsPDF. Knockdown HsPDF przez małe interferujące RNA prowadzi do zahamowania proliferacji komórek. Jeśli w działaniu przeciwnowotworowym aktynoniny pośredniczy hamowanie HsPDF, wzrost komórek musi w pewnym stopniu zależeć od aktywności HsPDF. Aby przetestować tę hipotezę, zbadaliśmy wpływ wyciszania ludzkiego genu Pdf na wzrost komórek nowotworowych. Transfekcja komórek HeLa małymi interferującymi RNA (siRNA), które specyficznie celują w ludzkie mRNA Pdf (Figura 5A) prowadzi do znacznego zmniejszenia zarówno mRNA Pdf (dane nie przedstawione) i ekspresji białka (Figura 5B), jak również zmniejszenia liczby komórek proliferację, o czym świadczy test inklotacji trytowanej tymidyny (Figura 5C) [patrz też: barszcz czerwony magdy gessler, laboratorium pruszcz gdański, dlaczego ziewanie jest zaraźliwe ] [podobne: rezonans magnetyczny puławy, szczepienie dur brzuszny, makijaz permanentny cena ] [przypisy: rezonans magnetyczny puławy, szczepienie dur brzuszny, makijaz permanentny cena ]