Wydalanie ludzkiej mitochondrialnej deformylazy peptydowej, nowy cel antyrakowy antybiotyków na bazie aktynoniny ad

Dlatego dane sugerują, że N-końcowe przetwarzanie białka jest ewolucyjnie konserwowane i może być ważne w chloroplastach lub mitochondriach przynajmniej niektórych organizmów eukariotycznych, chociaż jego rola u ssaków jest kontrowersyjna. Wcześniejsza praca w naszym laboratorium wykazała, że aktynonina, naturalnie występujący antybiotyk pochodzący z gatunku Streptomyces (19), który hamuje aminopeptydazę N (APN lub CD13), ma działanie antyproliferacyjne na ludzką białaczkę i komórki chłoniaka in vitro i działanie przeciwnowotworowe w syngenicznym AKR model myszy białaczki (20, 21). Jednak efekty antyproliferacyjne obserwowano w komórkach ujemnych pod względem APN, a zatem aktywność nie mogła być mediowana przez hamowanie APN. Dlatego szukaliśmy innego celu aktynoniny, który mógłby wyjaśnić jej selektywną aktywność przeciwnowotworową. Aktywne działanie aktynoniny na bakteryjne, roślinne i pasożytnicze PDFy (11, 12, 22) skłoniło nas do zbadania możliwości, że HsPDF może być nowym celem dla komórek rakowych, jeśli jest to funkcjonalnie ważny ludzki enzym mitochondrialny. Pokazujemy tutaj, że HsPDF jest funkcjonalnym enzymem mitochondrialnym niezbędnym do wzrostu i proliferacji komórek. Ponadto zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy klasę nowych inhibitorów opartych na aktynominie, które selektywnie hamują rozwój wielu różnych ludzkich komórek nowotworowych in vitro i ludzkich nowotworów in vivo u myszy. Proponujemy również model działania mechanizmu aktynoniny. Odkrycia te mają wpływ na opracowanie różnych strategii terapeutycznych dla bakterii, prątków, pasożytów lub raka, które są ukierunkowane na ten enzym. Wyniki Aktywność HsPDF wobec ludzkich substratów mitochondrialnych. Przyrównanie sekwencji ClustalW (23) (Figura 1) reszt aminokwasowych HsPDF w porównaniu z innymi postaciami PDF wykazuje, że ludzkie białko ma znaczącą identyczność (30. 40%) z innymi aktywnymi katalitycznie białkami. Ponadto, krytyczne reszty wiążące metal (C172, H214, H218) i reszta katalityczna (E215) są konserwatywne (18, 24, 25). Wcześniej opisywaliśmy klonowanie ekspresji i oczyszczanie HsPDF w badaniach enzymatycznych (13). N-końcowe skrócenie umożliwiło ekspresję rozpuszczalnego, aktywnego enzymu. Wszystkie podane tu analizy enzymatyczne przeprowadzono z podstawionym kobaltem N-terminalnym mutantem obciętym wydłużonym znacznikiem C-końca 6x-histydyny w celu oczyszczenia. Figura 1ClustalW wyosiowania sekwencji aminokwasowej HsPDF z bakteryjnymi, roślinnymi i pasożytniczymi sekwencjami PDF z bazy danych National Center for Biotechnology Information (NCBI) przy użyciu programu MacVector (Accelrys Inc.). Hs, Homo sapiens (NP_071736); Pf, P. falciparum (NP_704619); Ec, E. coli (NP_417745); At, A. thaliana (AAG33973 i AAG33980). Zbadaliśmy przydatność różnych peptydów formylowanych jako potencjalnych substratów (rysunek 2, A i B). HsPDF był w stanie zdeformować 2 formylowane peptydy, formyl-Met-Ala-His-Ala (fMAHA) i formylo-Met-Thr-Met-His (fMTMH), które zaprojektowano tak, aby naśladować N-końcową sekwencję aminokwasową 2 różnych human mitochondrialnie kodowane białka, odpowiednio oksydaza cytochromu c i podjednostka dehydrogenazy NADH. Wartości Kcat / Km (Tabela 1) dla tych mitochondrialnych peptydów są 5- do 10-krotnie wyższe niż dla ogólnego substratu formyl-Met-Ala-Ser (fMAS), który nie koreluje z żadnymi mitochondrialnie kodowanymi białkami. Ten wzrost Kcat / Km, czasami określany jako stała specyficzności. sugeruje wyższą skuteczność katalityczną w stosunku do peptydów mitochondrialnych. Co ciekawe, HsPDF nie był aktywny wobec peptydu bakteryjnego formyl-Met-Leu-Phe (fMLP / fMLF) (13). Figura 2Kinetyczna analiza aktywności HsPDF wobec mitochondrialnych peptydów. (A) Aktywność HsPDF mierzono jako funkcję fMAHA substratu (S) przy użyciu testu PDF sprzężonego z dehydrogenazą mrówczanową. (B) Aktywność HsPDF mierzono jako funkcję substratu fMTMH z zastosowaniem testu PDF sprzężonego z dehydrogenazą mrówczanową. Wszystkie oznaczenia są reprezentatywne dla co najmniej 2 niezależnych eksperymentów. Krzywe kinetyczne zostały wygenerowane przez program komputerowy KaleidaGraph (Synergy Software). Wartości kinetyczne uzyskane z tych krzywych przedstawiono w Tabeli 1. Tabela Wartości kinetyczne aktywności HsPDF z substratami mitochondrialnymi Lokalizacja HsPDF w mitochondriach żywych komórek. Pełnej długości sekwencja aminokwasów HsPDF zawiera N-końcową sekwencję, która według przewidywań służy jako motyw kierujący do mitochondriów (11). Aby przetestować hipotezę, że HsPDF jest kierowany do mitochondriów, transfekowaliśmy komórki HeLa konstruktami fuzyjnymi białka HsPDF (białko fluorescencyjne (HsPDF-YFP). Współogniskowa mikroskopia konfokalna wykazała, że pełnej długości HsPDF kolokalizuje z mitochondriami, które są zabarwione MitoTracker Red (Invitrogen Corp.) (Figura 3)
[patrz też: kamil juraszek, dlaczego ziewanie jest zaraźliwe, bytovia hpu ]
[więcej w: kamil juraszek, laboratorium pruszcz gdański, barszcz czerwony magdy gessler ]
[hasła pokrewne: kamil juraszek, laboratorium pruszcz gdański, barszcz czerwony magdy gessler ]