Wydalanie ludzkiej mitochondrialnej deformylazy peptydowej, nowy cel antyrakowy antybiotyków na bazie aktynoniny ad 9

SiRNA specyficzne dla ludzkiego Pdf (National Center for Biotechnology Information [NCBI] nr dostępu NM_022341) zostały umieszczone na 581. 601 i 659. 679 względem kodonu start i zostały porównane z sekwencjami w bazie danych ludzkiego genomu, aby potwierdzić, że nie inne geny były celem. Niespecyficzną pulę kontrolną dupleksu (Dharmacon Inc.) zastosowano jako kontrolę i złożono z 4 dupleksów zawierających 33% zawartości GC. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono dwukrotnie, w trzech powtórzeniach za każdym razem. Wzrost komórek HeLa określano przez wbudowanie trytowanej tymidyny w dniach 1, 2 i 3 po transfekcji. Oznaczanie poziomów mRNA HsPDF i ekspresja białka. Aby potwierdzić knockdown mRNA HsPDF, RNA komórki HeLa zebrano 24, 48 i 72 godziny po transfekcji siRNA. Całkowite RNA potraktowane DNazą (5 ug) zastosowano do przygotowania cDNA do późniejszej PCR w czasie rzeczywistym. Zastosowano system RT-PCR ThermoScript (Invitrogen Corp.) zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki cDNA rozcieńczono 1: 5 5 mM Tris-HCl (pH 8,5), a 3 .l użyto do reakcji 25 .l na 96-studzienkowej płytce reakcyjnej MicroAmp optycznej w układzie do wykrywania sekwencji ABI PRISM 7700 ( Applied Biosystems). Mieszanki główne zawierały 2 x TaqMan Universal Master Mix, wodę wolną od RNazy / DNazy i odpowiednie startery i sondę. Mieszanka wzorcowa HsPDF zawierała startery przy 700 mM i sondę HsPDF przy 200 mM. Mieszanka główna (3-aktyny (gen odniesienia odniesienia) zawierała startery przy 500 mM i sondę p-aktynową w stężeniu 150 mM. Sekwencje dla starterów (Gene Link Inc.) i sond (Applied Biosystems) są następujące: PDF starter do przodu 5a-GGGCAGCCCGCATCA-3 (3, starter do tyłu z 5. -TGCTGTCCATTTTGTCAATAAACA-3 (3, (3-aktyna do przodu primer 5. – CTGGCACCCAGCACAATG-3 (3, -actin reverse primer 5 (3-GCCGATCCACACGGAGTACT-3 (3, sonda PDF 6FAM-CAGCACGAGATGGACCACCTGCAG-TAMRA i sonda p-aktynowa 6FAM-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TAMRA. W przypadku końcowych obliczeń, każda wartość progowa cyklu każdej próbki została odjęta od jej odpowiedniej wartości p-aktyny. Do analizy ekspresji białka HsPDF, używaliśmy komórek HeLa trwale eksprymujących ten sam pełnej długości konstrukt HsPDF-YFP wykorzystywany w badaniach obrazowania konfokalnego. Jako kontrolę wykorzystaliśmy komórki HeLa stabilnie wyrażające fluorescencyjną kontrolę wektorową. Dwadzieścia cztery i 48 godzin po transfekcji siRNA komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej (Cytomics FC 500, Beckman Coulter Inc.) i średnią fluorescencję szczytową oznaczono za pomocą programu do analizy metodą cytometrii przepływowej (FlowJo 4.5, Tree Star Inc.). Dane dotyczące knockdown mRNA, białka i proliferacji siRNA są przedstawione jako średnia. SD i analizowano je pod kątem istotności statystycznej za pomocą ANOVA z post-testem Newmana-Keulsa przy użyciu Prism 3.0 (GraphPad Software). Testy proliferacji komórek. Do oceny antyproliferacyjnej aktywności aktynoniny wykorzystano różne linie komórek ludzkich i mysich. Ludzkie linie komórek nowotworowych obejmowały hematopoetyczne (Daudi, HL60, NB4, Raji, RL), raka sutka (MDA-MB-468, SK-BR-3), raka prostaty (CWR22Rv1, TSU-PRI, DU145, PC3), raka płuc (SK-LC-8, SK-LC-16), rak jajnika (A2780), rak szyjki macicy (HeLa) i inne (HEK293, HT-1080). Użyliśmy także ludzkich PBMC (hPBMC), ludzkich fibroblastów (WI-38), mysich fibroblastów (NIH-3T3) i mysiej linii komórkowej fibroblastów, NIH-3T3, transformowanej ras (AL67). Aby ocenić wpływ aktynoniny na proliferację komórek rakowych, zastosowano 2 różne testy. Wykazaliśmy wcześniej, że testy żywotności komórek, takie jak metabolizm XTT i wykluczanie błękitem trypanowym, bezpośrednio korelują z włączeniem trytowanej inkorporacji tymidyny z komórek traktowanych aktynoniną. Oznaczono, że był testem włączania trytowanej tymidyny, w którym podwielokrotność 200 ul komórek (10 000 komórek na studzienkę) wysiano i inkubowano w 37 ° C na 96-studzienkowych płytkach w obecności lub nieobecności aktynoniny. Seryjne rozcieńczenia aktynoniny wykonywano w kompletnych pożywkach. Po 1-5 dniach inkubacji do każdej studzienki dodano 50 .l 10 .C / ml trytowanej 3H-tymidyny (PerkinElmer Inc.) i pozostawiono na 5 godzin. Płytki zamrożono w ~ 80 ° C przez noc, a komórki zebrano na maty filtracyjne (PerkinElmer Inc.), stosując półautomatyczny aparat do zbioru (Skatron Instruments). Maty filtracyjne zliczano w liczniku scyntylacyjnym ciekłego Betaclate 1205 (PerkinElmer Inc.). Oznaczenie II było oznaczeniem XTT, w którym komórki w fazie logarytmicznej wysiewano na 96-studzienkowej płytce przy określonej gęstości. Actinonin dodano do płytki w różnych stężeniach wykonanych z seryjnych rozcieńczeń w kompletnych pożywkach. Gdy komórki w studzienkach kontrolnych osiągnęły konfluencję, do każdej studzienki dodano 50. L XTT soli tetrazolowej (rozpuszczonej w mg / ml w 37 ° C pożywce bez surowicy) z metosiarczanem fenazyny (odczynnik przeniesienia elektronu). płytkę i komórki inkubowano ponownie przez 2. 4 godziny w 37 ° C
[patrz też: porozumienie rodzicielskie wzór, rezonans magnetyczny otwarty warszawa, błonnik witalny opinie lekarzy ]
[patrz też: bytovia hpu pl, kamil juraszek, laboratorium pruszcz gdański ]
[patrz też: bytovia hpu pl, kamil juraszek, laboratorium pruszcz gdański ]