Wydalanie ludzkiej mitochondrialnej deformylazy peptydowej, nowy cel antyrakowy antybiotyków na bazie aktynoniny ad 8

Co ciekawe, aktynomina miała znaczące działanie przeciwnowotworowe w modelach mysich myszy z heteroprzeszczepem prostaty i raka płuc, zarówno jako środek doustny, jak i pozajelitowy. Ponadto, wstępne wyniki z SKI-AC-111111 sugerują, że analog jest nie tylko silniejszym czynnikiem antyproliferacyjnym in vitro w porównaniu z aktynoniną, ale jest również około 3 razy silniejszy jako środek przeciwnowotworowy in vivo w modelu heteroprzeszczepu ludzkiego raka prostaty ( dane nie pokazane). Jednakże mechanizmy pozornie selektywnej aktywności przeciwnowotworowej in vivo nie są jasne. Ostatnio zwrócono uwagę na mitochondria jako potencjalne cele terapii przeciwnowotworowej. Dowody sugerują, że mitochondria komórek nowotworowych są wystarczająco różne od normalnych komórek (44, 54), że komórki nowotworowe mogą być bardziej wrażliwe na zniewagę mitochondrialną. MKT-077, kationowy barwnik rodacyny, jest przykładem leku, który jest selektywnie toksyczny dla komórek nowotworowych (55), a jednym z wyjaśnień jego mechanizmu działania jest hamowanie oddychania mitochondrialnego. Ostatnio Fantin i in. (56) wykazali, że mitochondriotoksyczna mała cząsteczka może selektywnie hamować wzrost komórek nowotworowych. Zatem hamowanie HsPDF przez aktyynoninę, powodujące rozerwanie mitochondriów, może mieć podobną swoistość wobec nowotworu. Pokazujemy tutaj, że aktynonina nie powoduje depolaryzacji mitochondrialnej prawidłowych krążących limfocytów; to wskazuje na selektywność komórek nowotworowych. Przyczyna tego jest przedmiotem dochodzenia. Wzrost ludzkiej kolonii szpiku kostnego jest redukowany przez aktynominę in vitro (20); jednak w badaniach nad rakiem u myszy opisywanych tutaj, skuteczne przeciwnowotworowe dawki aktynoniny nie powodowały oczywistych toksycznych efektów ubocznych. W związku z tym dochodzimy do wniosku, że HsPDF jest nowym ludzkim enzymem mitochondrialnym, który może zapewnić nowy i selektywny nowotwór cel dla rozwoju terapii przeciwnowotworowych. Metody Odczynniki. N-formylowanymi substratami peptydowymi stosowanymi w teście deformylazy były formyl-Met-Ala-Ser (fMAS), formylo-Met-Ala-His-Ala (fMAHA) i formylo-Met-Thr-Met-His (fMTMH). Wszystkie substraty zostały zakupione lub zsyntetyzowane przez Bachem Bioscience Inc. Actinonin i CCCP zakupiono od Sigma-Aldrich. JC-1 (jodek 5,5, 6, 6a-tetrachloro-1,1, 3,3a-tetra-metylodwenzimidazolilokarbocyjaniny) zakupiono od Invitrogen Corp. Analogi aktynoniny zsyntetyzowano za pomocą Organicznej Syntezy Core Facility w Memorial Sloan- Kettering Cancer Center. Test PDF. Test spektrofotometryczny oparty jest na metodzie opisanej przez Lazennec i Meinnel (57) i jest testem sprzężonym z dehydrogenazą mrówkową pod kątem aktywności PDF. Nasze pomiary przeprowadzono w 25 ° C w kuwetach polistyrenowych zawierających 50 mM HEPES (pH 7,4), 10 mM NaCl, 0,2 mg / ml BSA, 2,4 mM NAD + (Roche Applied Science), U dehydrogenazę mrówczanową (Sigma-Aldrich), i 0,32 mM N-formylowany peptyd (Bachem Bioscience Inc.). Reakcję zapoczątkowano dodaniem 20 – 100 .g enzymu HsPDF. Szybkość wytwarzania NADH mierzono przez monitorowanie wzrostu absorbancji przy 340 nm za pomocą spektrofotometru Spectronic Genesys 2 (Spectronic Instruments). Lokalizacja HsPDF w żywych komórkach. Pełną sekwencję kodującą lub skrócenie nukleotydów kodujących pierwsze 63 aminokwasy ludzkiego cDNA Pdf zamplifikowano za pomocą PCR i sklonowano w ramce do pEYFP-N1 (BD Biosciences. Clontech). Komórki HeLa (American Type Culture Collection) utrzymywano w 5% CO2 w DMEM uzupełnionym 4 mM L-glutaminą, 4,5 g / l glukozy i 10% FBS (cellgro; Mediatech Inc.). Komórki HeLa, które mają być badane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, wysiewano w ilości 2 x 105 na płytkę na 35-mm szalki zawierające szklany szkiełko nakrywkowe 15-mm wycięcie (MatTek Corp.) i transfekowano następnego dnia za pomocą LipofectAMINE 2000 (Invitrogen Corp.) zgodnie z zgodnie z instrukcjami producenta. Aby zabarwić mitochondria, MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen Corp.) dodano do hodowli komórkowych 30 minut przed obrazowaniem. Żywe komórki obrazowano przy pomocy odwróconego skaningowego mikroskopu skaningowego Zeiss 510 (LSM, Carl Zeiss Inc.). Reprezentatywne obrazy zostały przetworzone za pomocą programu Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Systems Inc.). przygotowanie siRNA i transfekcja. Dwadzieścia cztery godziny przed transfekcją komórki HeLa poddano trypsynizacji, rozcieńczono świeżą pożywką bez antybiotyków i przeniesiono na 96-studzienkowe płytki z gęstością 10 000 komórek na studzienkę. W dniu transfekcji komórki (50-70% konfluencji) przemyto PBS, a pożywkę zastąpiono pożywką z obniżoną surowicą Opti-MEM I (Invitrogen Corp.). Transfekcje siRNA przeprowadzono za pomocą Oligofectamine (Invitrogen Corp.) zgodnie z instrukcjami producenta. Specyficzne dla celu dupleksy siRNA zostały zaprojektowane przy użyciu zastrzeżonego algorytmu SiRNA Core Facility Sloan-Kettering Institute i dostarczone w stężeniu 10 .m.
[hasła pokrewne: kamil juraszek, rezonans magnetyczny puławy, bytovia hpu pl ]
[przypisy: największa wagina na świecie, jak radzić sobie po rozstaniu, bytovia hpu ]
[więcej w: największa wagina na świecie, jak radzić sobie po rozstaniu, bytovia hpu ]