Substrat receptora insulinowego 2 odgrywa kluczową rolę w komórki i podwzgórze ad 9

Porównawczą analizę poziomów mRNA w różnych tkankach przeprowadzono za pomocą RT-PCR. Całkowity RNA traktowano DNazą wolną od RNazy (Nippon Gene Co.) i cDNA pierwszej nici wytworzono z losowymi 9-merowymi starterami i odwrotną transkryptazą (Takara Shuzo Co.). Mieszaninę odwrotnej transkrypcji amplifikowano specyficznymi starterami. Primery dla rekombinazy Cre były takie, jak opisano powyżej. Startery dla Irs2 były 5-GGTGCTAAGGTCATCCGTGCA-3. i 5a-TTTCACGACTGTGGCTTCCTTC-3 p, a startery dla 36B4 (kontrola) stanowiły 5 (3 -ATGCCCAGGGAAGACAGGGCGACC-3. i 5 -TTAGTCGAAGAGACCGAATCCCATA-3 .. Izolacja podwzgórza. Przeprowadzono badania na szklanej płytce chłodzonej lodem. Po pierwsze, romb był oddzielony przekrojem poprzecznym od reszty mózgu. Przekrój poprzeczny wykonano na poziomie chiazmii wzrokowej, która ogranicza przednią część podwzgórza i przechodzi przez spoidło przednie. Podwzgórze wycięto na podstawie spoidła przedniego jako odniesienia poziomego, a jako podwzgórza zastosowano linię między tylnym podwzgórzem a ciałami sutkowymi (31). Immunoprecypitacja i analiza Western blot. Immunoprecypitację i analizę Western błot przeprowadzono jak opisano wcześniej z pewnymi modyfikacjami (13). Aby ocenić poziomy ekspresji Irs2, wysepki i podwzgórza z myszy. HT-IRS2 i myszy kontrolnych zostały zhomogenizowane, a lizaty poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem anty-Irs2. Próbki rozdzielono następnie na żelu poliakryloamidowym i przeniesiono na membranę przenoszącą Hybond-P PVDF (Amersham Biosciences). W celu wykrycia fosforylacji Akt i Stat3, insulinę ludzką (5 jednostek / mysz) i leptynę (10 mg / kg / zastrzyk) (PeproTech EC Ltd.) wstrzyknięto do żyły ogonowej po tym, jak myszy głodzono przez ponad 16 godzin. Piętnaście minut po insulinie i 60 minut po wstrzyknięciu leptyny, homo- genom homogenizowano, a lizaty rozdzielano na żelu poliakryloamidowym i przenoszono na błonę przenoszącą Hybond-P PVDF (Amersham Biosciences). Błony inkubowano ze wskazanymi przeciwciałami anty-surowicy i sprzężonymi z HRP przeciwciałami anty-IgG. Prążki wykryto za pomocą odczynników do wykrywania ECL (Amersham Biosciences). Pomiar leptyny i lipidów. Myszy pościły przez ponad 16 godzin przed pomiarem. Stężenie leptyny w surowicy oznaczano za pomocą zestawu Quantikine M (R & D Systems Inc.). Stężenie całkowitego triglicerydów cholesterolu i wolnych kwasów tłuszczowych (Wako Pure Chemical Industries Ltd.) oznaczano metodami enzymatycznymi. Wrażliwość na leptynę. Myszy HT-IRS2 i kontrolne wstrzyknięto dootrzewnowo raz dziennie o 21:00 roztworem soli fizjologicznej lub leptyną (10 mg / kg / zastrzyk, PeproTech EC Ltd.), a następnie monitorowano ich masy ciała i pożywienie (32). Statystyczne znaczenie różnic w masie ciała i spożyciu pokarmu między grupami określono za pomocą testu ucznia (dwustronny). Eksperyment z ograniczeniem kalorii. Czterotygodniowe myszy HT-IRS2 i myszy kontrolne trzymano w pojedynczych klatkach i 3,5 g regularnego karmienia podawano pod koniec cyklu światła (21:00) każdego dnia przez pierwszy tydzień, a następnie 4,0 gramów na drugi dzień. przez cztery tygodnie. W dniu poprzedzającym rozpoczęcie eksperymentów myszy otrzymywały dostęp ad libitum do karmienia przez 12 godzin cyklu ciemności, aby uniknąć długotrwałych warunków na czczo. Generacja sond cRNA dla Irs2 i receptora leptyny. Produkty PCR poddano ligacji z wektorem za pomocą zestawu do klonowania TA (Invitrogen Corp.). Ryboosfory znakowane 35S wytworzono z fragmentów produktów PCR dla Irs2 i receptora leptyny przy użyciu zestawu do transkrypcji Sp6 / T7 zgodnie z instrukcjami producenta (Boehringer Mannheim GmbH). Sondy antysensowne dla Irs2 i receptora leptyny wytworzono odpowiednio przy użyciu polimerazy T7 i Sp6, a sondy sensowne dla Irs2 i receptora leptyny wytworzono stosując polimerazę Sp6 / T7 (33). Hybrydyzacja in situ i histochemia. Zamrożone wycinki o grubości 12 .m z mózgu myszy, które zawierały podwzgórze, pocięto w kriostacie w temperaturze około 20 ° C, a po rozmrożeniu na szkiełkach pokrytych żelatyną i chromem glinowym, sekcje te przechowywano w temperaturze około 80 ° C. Zamrożone skrawki tkanek pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut, a następnie utrwalono w 4% formaldehydzie w PBS (pH 7,5) przez 5 minut i przemyto dwukrotnie w PBS. Naprawione skrawki tkanki inkubowano przez 10 minut w 0,9% roztworze soli zawierającym 0,1 M trietanoloaminy i 0,25% bezwodnika octowego, a następnie odwodniono przez przeniesienie ich sekwencyjnie przez 70% (1 minuta), 80% (1 minuta), 95% (2 minuty), i 100% etanolu (1 minuta); i pozbawiono lipidów w 100% chloroformu przez 5 minut. Płytki częściowo odwodniono w 100% etanolu (1 minuta), a następnie 95% (1 minutę) etanolu i pozostawiono do krótkiego suszenia na powietrzu.
[podobne: kamil juraszek, zielone koktajle przepisy, rezonans magnetyczny puławy ]
[przypisy: bytovia hpu, bytovia hpu pl, kamil juraszek ]
[podobne: bytovia hpu, bytovia hpu pl, kamil juraszek ]