Substrat receptora insulinowego 2 odgrywa kluczową rolę w komórki i podwzgórze ad 8

Konwencjonalne Irs2. /. i myszy. HT-IRS2 wykazywały oporność na leptynę. Stwierdzono, że leptyna zmniejsza wydzielanie insuliny (28). Nie można zatem wykluczyć, że obniżona aktywność leptyny prowadzi do zwiększonego wydzielania insuliny w konwencjonalnym Irs2. /. i myszy. HT-IRS2. W przyszłym badaniu planujemy generować i analizować myszy, które są szczególnie niedoborowe w Irs2. komórki, ale nie w podwzgórzu. W przeciwieństwie do Irs2. /. myszy, które rozwijają cukrzycę w wieku 10 tygodni, myszy. HT-IRS2 nie stają się cukrzykami. To oznacza, że. dysfunkcja komórek i otyłość z powodu dysfunkcji podwzgórza są niewystarczające dla rozwoju cukrzycy. W rzeczywistości wcześniej wykazano, że wątrobowa odbudowa Irs2 w Irs2. /. myszy, stosując wektor adenowirusowy, zapobiegały rozwojowi cukrzycy (18). Ta obserwacja wskazuje, że nieobecność Irs2 w podwzgórzu i. komórki są niewystarczające do rozwoju cukrzycy. Metody Konstruowanie wektora docelowego, hodowli komórek ES i generacji zmutowanych myszy. Aby skonstruować wektory docelowe dla genu Irs2, biblioteka mysiego genomowego DNA 129 / Sv zapakowana w Lambda DASH II (BD Biosciences. Clontech) została przebadana za pomocą sond z użyciem genów DNA 5. -Side i 3. -Side jako myszy (sondy C i B odpowiednio na ryc. 1A). Wyizolowano sondę C 3 klonów zawierających Irs2 i sondę B w celu wyizolowania 4 klonów zawierających ten gen. Skonstruowaliśmy 2 wektory celujące (tv. S): tv-1 był zmutowanym genem oporności na neomycynę wprowadzonym do 3. stronie genu Irs2, a tv-2 została wprowadzona do 5. bok (rysunek 1A). Najpierw transfekowaliśmy tv-1 do embrionalnych komórek macierzystych J1 (129 / Sv) przez elektroporację i przesiewano je pod kątem rekombinowanych homologicznych klonów za pomocą analizy Southern blot, jak opisano wcześniej (29) (Figura 1B, lewy panel). Następnie zamknięte koliste DNA pCre-Pac transfekowano przez elektroporację do homologicznego rekombinowanego klonu w celu usunięcia floxed neoR z tv-1 sposobem opisanym gdzie indziej z niewielkimi modyfikacjami (30), a delecja neoR została potwierdzona przez analizę Southern blot (Rysunek 1B, środkowy panel). Na koniec, tv-2 poddano elektroporacji do rekombinowanego klonu bez neoR i ponownie przeszukiwano pod kątem rekombinowanych klonów homologicznych za pomocą analizy Southern blot (Figura 1B, prawy panel). Komórki wstrzyknięto do blastocyst od myszy C57Bl / 6 i przeniesiono do samic ICR pseudoprecyzyjnych, aby wytworzyć chimeryczne myszy (29). Męskie myszy chimeryczne o barwie agouti były łączone z samicami C57B1 / 6 w celu wytworzenia myszy heterozygotycznych (Irs2lox / +) (szacowany udział każdego tła genetycznego: 50% 129 / Sv i 50% C57B1 / 6) (29). Zwierzęta i genotypowanie. Myszy trzymano w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność i podawano albo zwykłą Chow CE-2 (CLEA Japan Inc.) składającą się z 25,6% (wag./wag.) Białka, 3,8% włókna, 6,9% popiołu, 50,5% węglowodanów, 4% tłuszczu i 9,2% wody lub diety wysokotłuszczowej 32 (CLEA Japan Inc.), składającej się z 25,5% (wag./wag.) Białka, 2,9% błonnika, 4,0% popiołu, 29,4% węglowodanów, 32% tłuszczu i 6,2% wody. Myszy RIP-Cre (C57B1 / 6) zakupiono w Jackson Laboratory. Myszy Irs2lox / + myszy (50% 129 / Sv, 50% C57Bl / 6) myszy RIP-Cre (C57Bl / 6), a następnie wyhodowano potomstwo Irs2lox / + / RIP-Cre (25% 129 / Sv, 75 % C57B1 / 6) myszami Irs2lox / + (25% 129 / Sv, 75% C57Bl / 6) w celu wytworzenia myszy Irs2lox / lox / RIP-Cre (25% 129 / Sv, 75% C57B1 / 6), które mają takie same pochodzenie genetyczne, jak te, które wykorzystaliśmy w poprzednim badaniu (22). Wszystkie eksperymenty w tym badaniu przeprowadzono z użyciem samców myszy z rodzaju miot . Genotypowanie przeprowadzono przez amplifikację PCR ogonowego DNA od każdej myszy w 3 tygodniu życia. Startery dla rekombinazy Cre były 5 (3-ACATGTTCAGGGATCGCCAGG-3. i 5 (3 -TAACCAGGAGAACACCATTGC-3a, a startery dla alleli Irs2 i floxed Irs2 to 5a-CCAGTGGGTGGCTTGTGGGTAGG-3a, 5a-CAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTC-3a i 5a-GCCATGTCCTTACAACCATTAGCGG-3 .. Aby wykryć rekombinację za pośrednictwem Cre na poziomie genomowego DNA różnych tkanek za pomocą PCR, zaprojektowaliśmy startery dla górnej części genomowego DNA Irs2 (primer a), Neo DNA (primer b) i dalszej części genomowego DNA Irs2 (primer) c) (patrz rysunek 1A). Starterem a był 5 (3-CCAGTGGGTGGCAGTGTGGGTAAGA-3 (3, starter b był 5 (3-CAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTT-3 (3, a starter c był 5 (3 -CCCATGTCTGCTTGTATGGAGAGCC-3 .. Te pary starterów dają produkty PCR o wielkości 0,2 kb i 0,4 kb przed, odpowiednio, i po delecji Irs2, w której pośredniczy Cre. Opieka nad zwierzętami i procedury eksperymentów zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Tokijskiego. Przygotowanie RNA i RT-PCR. Całkowity RNA przygotowano z różnych tkanek za pomocą odczynnika izolującego ISOGEN Total Reagent RNA (Nippon Gene Co.) zgodnie z instrukcjami producenta
[hasła pokrewne: narodowy fundusz zdrowia sanatorium, rezonans magnetyczny otwarty warszawa, największa wagina na świecie ]
[podobne: jak przygotować bakłażana, największa wagina na świecie, jak radzić sobie po rozstaniu ]
[więcej w: jak przygotować bakłażana, największa wagina na świecie, jak radzić sobie po rozstaniu ]