Substrat receptora insulinowego 2 odgrywa kluczową rolę w komórki i podwzgórze ad 10

Hybrydyzację prowadzono w 50 ° C przez noc w 46. L buforze składającym się z: 42. L 23,9 mM TrisCl, 0,63 mM EDTA, 359,7 mM NaCl, 59,4% formamidu, 12% siarczanu dekstranu (500 000 moli wagowo), i 2,4% roztworu Denhardta; 2 .l roztworu DNA nasienia łososia 2,5 mg / ml (Sigma-Aldrich) i 5 mg / ml całkowitego RNA drożdży (Sigma-Aldrich); i około 2 .l znakowanych 35S antysensownych i sensownych sond (1 x 106 cpm na szkiełko) pod szkiełkami nakrywkowymi Nescofilm (Bando Chemical IMD) (33,34). Preparaty płukano w 2 x SSC (1 x SSC: 150 mM NaCl, 15 mM cytrynian sodu) i przemywano przez 30 minut w 2 zmianach 2 x SSC zawierających 50% formamid w 50 ° C przed inkubacją w 37 ° C w 2 x SSC zawierający 20 ul / ml RNazy A (Sigma-Aldrich). Po dalszych 45 minutach prania w 3 zmianach 2 x SSC zawierających 50% formamidu w 50 ° C, szkiełka płukano przez 10 minut w 2 zmianach 2 x SSC w temperaturze pokojowej i po krótkim zanurzeniu w wodzie i 70% etanolu, były one suszone na powietrzu. Skrawki hybrydyzowane z rybosonkami eksponowano na folie przez 3 dni. Skrawki hybrydyzacyjne transkryptu Irs2 były eksponowane na film autoradiograficzny (Hyperfilm, Amersham Biosciences). Powstałe obrazy analizowano za pomocą komputerowej densytometrii przy użyciu analizatora obrazowania MCID (Imaging Research Inc.). Średnią gęstość optyczną autoradiogramów zmierzono porównując ją z jednocześnie eksponowanymi próbkami mikroskali [14C] (Amersham Biosciences). In vitro homeostaza glukozy. Testy tolerancji glukozy i insuliny przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanymi metodami (32). Analiza histologiczna i immunohistochemiczna wysepek. Cztery samce myszy po 10 dniach i pięć samców myszy po 12 tygodniach zastosowano dla każdego genotypu, a fragmenty trzustki oceniono morfometrycznie. Do analizy immunohistochemicznej skrawki trzustki barwiono anty-insuliną (DakoCytomation Co.) lub przeciwciałami anty-Pdx1 (35), a obszary wysepek śledzono ręcznie i analizowano za pomocą oprogramowania Win ROOF (Mitani Co.), jak opisano wcześniej. (10). W każdej grupie analizowano ponad 50 wysepek na mysz. Proliferacja komórek. BrdU (100 mg / kg w soli fizjologicznej) wstrzyknięto dootrzewnowo, a 6 godzin później myszy perfundowano 4% paraformaldehydem i ich trzustka utrwalono w 4% paraformaldehydzie w PBS. Techniki barwienia immunohistochemicznego przeprowadzono za pomocą zestawu Cell Proliferation Kit (Amersham Biosciences) zgodnie z wcześniej opisaną metodą (36). W przypadku immunohistochemii skrawki utrwalono w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej, zatopiono w parafinie, podzielono na 2 pm i wybarwiono kontrastowo hematoksyliną. Oznaczone komórki i całkowite komórki w wysepkach zliczono w 3 przekrojach na próbkę, a wskaźniki znakowania obliczono jako stosunek wyznakowanych komórek do całkowitego stosunku komórek wysepek z więcej niż 4 osobników na grupę. Analiza jednoniciowa DNA w wysepkach. Myszy perfundowano 4% paraformaldehydem i ich trzustka utrwalano w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 ° C przez noc, zatapiano w parafinie i pocięto na sekcje o grubości 2 .m. Skrawki blokowano 10% surowicą cielęcą w PBS przez 20 minut, a następnie inkubowano z poliklonalnym przeciwciałem przeciwko jednoniciowemu DNA przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Surowicę surowicy koziego zamiast jednoniciowego DNA zastosowano do kontroli ujemnych. Metodę kompleksu streptawidyna-biotyna z zestawem LSAB (DakoCytomation Co.) zastosowano do immunohistochemii zgodnie z instrukcjami producenta. Taqman PCR. Ilościową analizę poziomów mRNA w wysepkach i podwzgórzu przeprowadzono za pomocą RT-PCR opartej na fluorescencji. Mieszaninę odwrotnej transkrypcji amplifikowano specyficznymi starterami przy użyciu detektora sekwencji ABI Prism 7000 wyposażonego w termocykler. Startery stosowane dla Pdx1, Hnf3a, Hnf1a, Hnf4a, Foxo1 i P-aktyny były jak opisano wcześniej (22). Względne poziomy ekspresji porównywano pomiędzy. HT-IRS2 i myszami kontrolnymi po normalizacji do P-aktyny. Izolacja wysepek i. przygotowanie komórek. Izolowanie wysepek od myszy każdego genotypu przeprowadzono jak opisano wcześniej z pewnymi modyfikacjami (13). Po zaciśnięciu wspólnego przewodu żółciowego w punkcie bliskim otwarciu do dwunastnicy, wstrzyknęliśmy kolagenazę (Sigma-Aldrich) do przewodu trzustkowego. Opuchniętą trzustkę usunięto i inkubowano w 37 ° C przez 3 minuty. Trzustkę zdyspergowano przez pipetowanie, a zdyspergowane komórki przemyto dwukrotnie buforem wodorowęglanowym Krebs-Ringer. Pojedyncze komórki wyizolowano za pomocą trypsyny-EDTA (Invitrogen Corp.), jak opisano wcześniej (13). Analiza zawartości i wydzielania insuliny. Zawartość insuliny i wydzielanie zmierzono zgodnie z wcześniejszym opisem z niewielkimi modyfikacjami (13)
[patrz też: szczepienie dur brzuszny, największa wagina na świecie, narodowy fundusz zdrowia sanatorium ]
[hasła pokrewne: laboratorium pruszcz gdański, barszcz czerwony magdy gessler, rezonans magnetyczny puławy ]
[hasła pokrewne: laboratorium pruszcz gdański, barszcz czerwony magdy gessler, rezonans magnetyczny puławy ]