Rola limfotoksyny powierzchniowej w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia niezależna od LIGHT czesc 4

Częstotliwość limfocytów T 11,11 została określona dla każdej myszy biorcy przez barwienie znakowanym PE KJ126 (Caltag Laboratories Inc.). Komórki T z DO11.10 barwiono również Abs na CD69 i CD25 (PharMingen). Testy proliferacji komórek T. W celu oceny odpowiedzi komórek T w modelu EAE szczura, odwadniające LNP pachwinowe zebrano ze wszystkich grup leczenia w dniu 7 i 10 przebiegu choroby. Komórki T CD4 + oczyszczono przez negatywną selekcję z dysocjowanych komórek LN przez przepuszczenie ich przez szczurzą kolumnę do odzyskiwania komórek CD4, zgodnie ze specyfikacją producenta (Cedarlane Laboratories Inc.). Czystość potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu Abs do B220, CD4 i CD8 (PharMingen), a preparaty były konsekwentnie 98% limfocytów T CD4 +. Komórki T hodowano następnie w 96-studzienkowych płytkach przy gęstości 2 x 105 komórek / studzienkę z 5x 105 napromieniowanymi (30 Gy) kontrolnymi splenocytami kontrolnymi na studzienkę w całkowitej objętości 200 ul RPMI (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) uzupełniony 5% FBS (JRH Biosciences Inc., Lenexa, Kansas), 100 U / ml penicyliny (BioWhitaker Inc., Walkersville, Maryland, USA), 2 mM L-glutaminy (BioWhitaker Inc.) i 5 M 2-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich). Komórki hodowano w 37 ° C w 5% CO2 w obecności lub pod nieobecność (tło) różnych stężeń peptydu MBP. Jako kontrolę pozytywną zastosowano anty-szczurzą CD3 (PharMingen) w stężeniu 5 .g / ml (dane nie przedstawione). Po 72 godzinach zebrano 100 .l supernatantu i pożywkę zastąpiono RPMI zawierającym .l 3H tymidyny przez 6 godzin. Średnią inkorporację tymidyny w DNA mierzono w trzech powtórzeniach odwiertu za pomocą zliczania scyntylacyjnego w cieczy. W celu oceny odpowiedzi limfocytów T w modelu SJL R-EAE, osuszanie LNP pachwinowych zbierano w dniu 7 lub dniu 10, a śledziony zbierano w 39 lub 59 dniu. Zawiesiny pojedynczych komórek LN lub zawiesiny komórek śledziony, w których znajdują się czerwone krwinki poddano lizie wysiewano przy gęstości 5 x 105 komórek / studzienkę w 96-studzienkowej płytce w RPMI w obecności lub pod nieobecność (tło) różnych stężeń PLP139a115. Jako kontrolę pozytywną zastosowano anty-mysie CD3 (PharMingen) w stężeniu 5 .g / ml (dane nie pokazane). Po 72 godzinach zebrano 100 .l supernatantu i pożywkę zastąpiono RPMI zawierającym .l 3H tymidyny przez 18 godzin. Średnią inkorporację tymidyny w DNA mierzono w trzech powtórzeniach odwiertu za pomocą zliczania scyntylacyjnego cieczy. W przypadku odpowiedzi limfocytów T DO11.10 ex vivo, drenujące LN-y pachwinowe izolowano w dniu 7 po immunizacji. Komórki T CD4 + od myszy biorcy oczyszczono przy użyciu kolumny do odzyskiwania komórek CD4 specyficznej dla myszy zgodnie ze specyfikacją producenta (Cedarlane Laboratories Inc.). Czystość potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu Abs do B220, CD4 i CD8 (PharMingen), a preparaty były konsekwentnie 98% limfocytów T CD4 +. Komórki T KJ126 + (10 000) wysiano z 200 000 napromieniowanych splenocytów BALB / c i zmienne stężenia OVA323. 339 w całkowitej objętości 200 ul RPMI (Sigma-Aldrich). W niektórych przypadkach limfocyty T CD4 + wstępnie znakowano CFSE przez 10 minut w 37 ° C, a następnie barwiono znakowanym PE KJ126 (Caltag Laboratories Inc.) i anty-CD4 (PharMingen) po 3 dniach hodowli z OVA323. 339. W innych przypadkach płytki pulsowano Ci 3H tymidyny przez 6 godzin. Średnią inkorporację tymidyny w DNA mierzono w trzech powtórzeniach odwiertu za pomocą zliczania scyntylacyjnego w cieczy. Pomiar cytokin metodą ELISA. Supernatanty z testów proliferacji szczurów i myszy zebrano po 72 godzinach hodowli i IFN-y. stężenia w supernatantach określano za pomocą odpowiednich kanapkowych testów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta (BioSource International, Camarillo, Kalifornia, USA). Analiza nacieków w OUN. Leukocyty związane z OUN wyizolowano z całej tkanki szczurzego OUN po perfuzji heparyny-soli fizjologicznej szczurów, izolacji i homogenizacji rdzeni kręgowych oraz oczyszczenia gęstości gradientu Percoll (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Szwecja), jak opisano (26). Komórki inkubowano z przeciwciałami Ab do szczurzego CD4, CD8 i B220 (wszystkie PharMingen). Dane dotyczące cytometrii przepływowej uzyskano na FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California, USA). Histologia. Rozproszone próbki OUN uzyskano od zwierząt perfundowanych solą fizjologiczną heparyny i przechowywano w 10% zbuforowanej formalinie. Zatopione w parafinie skrawki szyjki macicy, klatki piersiowej i odcinka lędźwiowego szczura i rdzenia kręgowego myszy barwiono H & E pod mikroskopem optycznym. Kable rdzeniowe myszy barwiono również błękitem Luxol (LFB) i barwiono kontrastowo fioletem krezylowym. Całkowitą liczbę komórek i liczbę ciał apoptotycznych zliczano ręcznie w polach x 400 H i E z czterech myszy z każdej grupy leczenia.
[patrz też: makijaz permanentny cena, narodowy fundusz zdrowia sanatorium, laboratorium pruszcz gdański ]
[przypisy: bytovia bytów, rezonans magnetyczny otwarty warszawa, zielone koktajle przepisy ]
[podobne: bytovia bytów, rezonans magnetyczny otwarty warszawa, zielone koktajle przepisy ]