Nadciśnienie z docelowej ablacji chromograniny A może zostać uratowane przez ortologa człowieka ad 9

Spośród 58 wytworzonych młodych, tylko 6 miało zintegrowane DNA BAC, jak wskazała analiza PCR genomowego DNA tkanki ogonowej. Spośród tych sześciu, 3 miał wbudowany cały gen BAC CHGA do swoich genomów. Założyciel myszy nr. 31 miał cały gen CHGA i całe sekwencje powyżej i poniżej obecne w wstawce BAC i wykazywały transmisję linii zarodkowej. Analiza Southern blot potwierdziła integrację kopii transgenu. Mioty z CHGA + /. linia pochodząca od założyciela nie. 31 (tło CB6) pokryto przez 4 pokolenia w celu uzyskania homozygotycznego stanu CHGA + / + Chga + / + na podłożu CB6. Myszy CHGA + / + Chga + / + (tło CB6) były łączone z Chga. /. myszy (C57BL / 6J x 129 / SvJ tło) w celu wytworzenia CHGA + / y Chga + /. myszy. Littermate hodowlane wyprodukowało CHGA + / + Chga. /. myszy humanizowane w locus CHGA na mieszanym tle C57BL / 6J × 129 / SvJ × BALB / c. Weryfikacja celowania genowego w ekspresję mRNA in vivo: RT-PCR w czasie rzeczywistym. Testy RT-PCR w czasie rzeczywistym następujących transkryptów wyrażonych w nadnerczach Chga + / + i Chga. /. myszy przeprowadzono stosując specyficzne dla regionu kodującego startery, jak opisano poprzednio (56): Chga (jako kontrola negatywna), Chgb, Scg2, Dbh, Pnmt, Th, Vmat1 i Vmat2. W każdym przypadku amplifikowano pięć nanogramów cDNA nadnerczy. Wyniki wyrażono jako stosunek do wartości określonych dla rybosomalnego RNA 18S (rRNA), który zastosowano jako kontrolę ilości / jakości RNA w równoległych amplifikacjach. Profil ekspresji obu genów CHGA i Chga analizowano w różnych tkankach (założyciel nr 31) za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem specyficznych dla regionu kodującego starterów, jak opisano powyżej dla genu Chga. Następujące pary starterów użyto do specyficznego wykrywania tylko ludzkiego CHGA: przedni primer, 5a-CTGAAAGAGGCGGTGGAAGA i odwrotny primer, 5a-GAGAAAAGTGGTGAAGCCACAGA. Wyniki wyrażono jako wartości hratio do wartości wyznaczonych z rRNA 18S. Ekspresja białka: test immunoblot. Badaliśmy ekspresję Chga, Chgb i Dbh na poziomie białka w 10 g białka z homogenatów gruczołów nadnerczy Chga + / + i Chga. /. myszy z użyciem następujących przeciwciał z Santa Cruz Biotechnology Inc .: Chga (kozowy poliklonalny epitop mapujący C-końcowy region 20 aminokwasowy ludzkiego Chga), Chgb (kozie poliklonalne odpowiadające C-terminalnemu 19 aminokwasowemu regionowi ludzkiej Chgb), Dbh (króliczego poliklonalnego epitopu mapującego C-końcowy region aminokwasu 391. 630 ludzkiego Dbh) i detekcję chemiluminescencyjną. Jako kontrolę mierzono ekspresję P-aktyny (kozie poliklonalne odpowiadające C-końcowemu 11 aminokwasowi ludzkiej aktyny) w każdej próbce. Morfologia Przygotowanie tkanki. Nadnercza z 6 Chga + / + i 8 Chga. /. zwierzęta usunięto i utrwalono za pomocą 5% aldehydu glutarowego w 0,05 M buforze kakodylanu sodu, utrwalono w 1% tetratlenku osmu i osadzono w eponie 812 jak opisano poprzednio (57). Cienkie wycinki z wybranych bloków tkanki pocięto ultramrotronem LKB, wybarwiono octanem uranu i cytrynianem ołowiu i zbadano za pomocą mikroskopu elektronowego Hitachi H-600 (57). Morfometria. Tradycyjna technika stereologiczna została wykorzystana do określenia objętości komórek chromatyny w utrwalonych aldehydem glutarowym, zatopionych w żywicy epoksydowej, barwionych błękitem toluidyny (57). Objętość komórek określono przy powiększeniu x 1000 przy użyciu amerykańskiego mikroskopu optycznego. Objętość pojedynczego jądra (Vn) obliczono ze średniej średnicy (D) jądra przez bezpośrednie pomiary jego największych przekrojów poprzecznych w odcinkach szeregowych, stosując równanie Vn = / 6d3. Objętość przeciętnej komórki chromowej (Vc) obliczono z jej objętości jądrowej (Vn) i gęstości objętościowej jądra (Vvn) w komórce, stosując równanie Vc = Vn / Vvn. Vvn uzyskano stosując metodę liczenia punktowego (58, 59), dzieląc liczbę punktów padających na jądra przez całkowitą liczbę punktów leżących nad komórkami chromatyny (jądro i cytoplazmę). Liczenie punktów przeprowadzono za pomocą kwadratowej siatki kratowej zawierającej 121 punktów testowych dopasowanych do okularu. Objętość cytoplazmatyczną (Vcy) obliczono następnie przez odjęcie Vn od Vc. Metoda zliczania punktowego (58, 59) została również wykorzystana do oszacowania gęstości objętościowej i bezwzględnej objętości granulek chromu poprzez nałożenie przezroczystej nakładki z podwójną siatką siatki na mikrografach elektronowych komórek chrominowych. Granulki chromatyny. Vv (który jest objętością danego składnika komórkowego na jednostkę objętości cytoplazmy) otrzymano przez podzielenie sumy punktów opadających na granulki wydzielnicze przez całkowitą liczbę punktów zliczonych na cytoplazmie komórek chromatyny. Wartości wyrażono jako wartości procentowe objętości cytoplazmatycznej chromatyny zajmowanej przez granulki chromu (Vv,%), otrzymane przez pomnożenie gęstości objętości przez 100
[hasła pokrewne: szczepienie dur brzuszny, porozumienie rodzicielskie wzór, laboratorium pruszcz gdański ]
[patrz też: zielone koktajle przepisy, jak przygotować bakłażana, największa wagina na świecie ]
[przypisy: zielone koktajle przepisy, jak przygotować bakłażana, największa wagina na świecie ]