Nadciśnienie z docelowej ablacji chromograniny A może zostać uratowane przez ortologa człowieka ad 8

Wyizolowaliśmy 2 nachodzące na siebie mysie klony genomowe Chga z biblioteki izogenicznej (mysi szczep 129 / Sv) genomowego DNA (w faga lambda-FIX [Stratagene], z Instytutu Burnhama, La Jolla, Kalifornia, USA). Trzy ramiona izogenicznego genomowego DNA Chga wstawiono do wektora pFlox (Figura 1). Komórki ES (szczep CJ7, pochodzący od myszy 129 / Sv) transfekowano 40 .l liniowego konstruktu kierującego przez elektroporację (450 V, 250 .F). Po początkowej selekcji wybrano pojedynczą (pozytywną) selekcje aminoglikozydu G-418 (genetyna, 0,3 mg / ml), 192 dodatnie (to znaczy oporne na G-418a) i sklonowano. Przeszukiwanie pozytywnego klonu przeprowadzono za pomocą analizy Southern blot. Podczas gdy sonda BamHI / XhoI o 1,3 kbp wykryła fragment BamHI o około 13 kbp z genomowego DNA komórek ES typu dzikiego, fragmenty BamHI o długości około 13 kbp i około 7 kbp wykryto w genomowym DNA 2 pozytywnych klonów na zewnątrz. z 192 ognisk używanych do badań przesiewowych. Pozytywne klony były kariotypowane, a 3 miejsca loxP zostały zweryfikowane przez PCR i kotransfekowane (przez elektroporację) plazmidem ekspresyjnym rekombinazy Cre (55). Negatywna selekcja gancyklowirem (2 uM) zapewniała presję selekcyjną w otrzymywaniu ognisk z wycięciem całej kasety selekcji (PGK-Neo plus HSV-TK), która była flankowana przez 2 miejsca loxP. Powstałe ogniska były przesiewane przez 2 różne zestawy starterów PCR, zestaw flankujących każde z wymaganych 2 miejsc loxP w delecji typu II (warunkowego) (55). Delecja typu I (ostateczna) wycina cały ekson i około 1,5 kbp proksymalnego promotora, tym samym całkowicie dezaktywując allel Chga. Pomyślnie ukierunkowane i usunięte klony komórek ES zidentyfikowano metodą PCR. Pożądane komórki ES poddano mikroiniekcji (X10 komórek / blastocysty) do blastocyst żywiciela uzyskanych ze szczepu myszy C57BL / 6J (czarny, bez agouti). Po wszczepieniu (w samice pseudoprecyzyjnej samicy szwajcarskiej albino CD1), ciąży i odsadzeniu chimeryczne myszy zidentyfikowano za pomocą chimeryzmu pigmentacji płaszcza. Testem na transmisję docelowego transgenów linii zarodkowej było wytworzenie potomstwa o odpowiednim kolorze sierści w krzyżówce wstecznej do szczepu typu dzikiego (C57BL / 6J). Heterozygoty płci męskiej i żeńskiej z linii płciowej (Chga + / y, szczep tła 129 / SvJ) krzyżowano w celu uzyskania pokolenia F1, około jednej czwartej z nich było homozygotyczne pod względem delecji typu I lub typu II. Jak wskazuje PCR na ogonie DNA, szczeniąt F1. diploidalne genotypy Chga scharakteryzowano jako: typ dziki (Chga + / +), heterozygotyczny (Chga + / y) lub homozygotyczny zerowy (Chgaa / y). Zwierzęta użyte do tych badań były miotami wytwarzanymi przez krzyż heterozygoty F1 myszy (Chga + / y), które dawały mioty z Chga + / +, Chga + /. I Chga. /. myszy. Chga. /. myszy były później inbredowane przez 7 pokoleń w celu ustalenia jednorodnej Chga. /. linia myszy. Wytwarzanie humanizowanych myszy CHGA [0086] Wkładkę 2108679 bp klonu BAC RP11-862G15, komponent kontryk z ludzkim 14 NT_026437 obejmujący locus pomiędzy 87 162 128 i 87 372 986 bp, otrzymano z BACPAC Resources (Children s Hospital Oakland Research Institute). Ten klon ma pełny gen CHGA (12 150 bp) oflankowany przez natywne sekwencje ludzkie, 44 068 bp powyżej i 154,651 bp poniżej (Figura 7A). Region kodujący CHGA i promotor sekwencjonowano i potwierdzono, że reprezentują allel typu dzikiego. Amplifikację genu CHGA i sekwencji flankujących oraz sekwencjonowanie produktów PCR przeprowadzono przy użyciu starterów oligonukleotydowych. Podczas klonowania i amplifikacji nie wykryto żadnych rearanżacji. Startery były specyficzne dla genu ludzkiego, ponieważ nie udało im się zamplifikować mysiego genomowego DNA i dlatego były skuteczne w badaniach przesiewowych myszy transgenicznych. Superskręcone DNA BAC, wolne od genomowego DNA E. coli, przygotowano najpierw przy użyciu zestawu QIAGEN Large-Construct Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Osad DNA otrzymany na końcu preparatu zawieszono ponownie w 10 mM Tris-HCl, mM EDTA, pH 8,0 i poddano wirowaniu w nocnym gradiencie gęstości przy użyciu cezu z wirnikiem vTi80 przy 305,214 g w 18 ° C. Dolne pasmo reprezentujące zwojone DNA wyizolowano i poddano ekstrakcji za pomocą nasyconego NaCl butanolu w celu usunięcia bromku etydyny, wytrącono etanolem i przemyto 70% etanolem. Wysuszony osad delikatnie zawieszono ponownie w buforze do iniekcji (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, pH 8,0 i 100 mM NaCl) i zastosowano do wytworzenia myszy transgenicznych BAC przez mikroiniekcję konstruktu do pojedynczej komórki, zapłodnionej. Zygoty F1 hybrydowych myszy BALB / cx C57BL / 6J (CB6)
[patrz też: błonnik witalny opinie lekarzy, bytovia bytów, barszcz czerwony magdy gessler ]
[patrz też: dlaczego ziewanie jest zaraźliwe, bytovia bytów, rezonans magnetyczny otwarty warszawa ]
[podobne: dlaczego ziewanie jest zaraźliwe, bytovia bytów, rezonans magnetyczny otwarty warszawa ]