Mucyna komórkowa MUC1 jest krytycznym elementem bariery śluzówkowej dla infekcji ad 7

Komórki HeLa eksponowano na 200 jednostek / ml CDT przez 0, 6 lub 24 godziny. Pozakomórkową domenę i jądra MUC1 barwiono i badano za pomocą mikroskopii konfokalnej. (B) Ekspresję MUC1 w komórkach raka szyjki macicy HeLa trwale eksprymujących 2 różne shRNA MUC1 (M1.3, M1.4, 2 hodowle, A i B, dla każdego shRNA) lub shRNA kontrolnej (lucyferazy) określono za pomocą cytometrii przepływowej (zacieniowane). obszar reprezentuje przeciwciało kontrolne, linie pokazują zabarwienie MUC1); procentowe zmniejszenie mediany fluorescencji w nawiasach. Komórki macierzyste i subliny eksponowano na 16. 100 AU / ml CDT przez 48 godzin. Odsetek komórek w fazach S / G2 + M cyklu komórkowego i procent komórek w apoptozie (aneksyna VP pozytywna) określono za pomocą cytometrii przepływowej. (C) Klon eksprymujący EM10 MUC1 (3 komórek HCT116 eksponowano na 200 AU / ml CDT przez 0, 6 lub 24 godziny i barwiono jak w A. (D) Stabilne klony komórek HCT116 transfekowanych MUC1 lub wektorem pcDNA3 ( patrz ekspresja MUC1 na Figurze 2D) były eksponowane na CDT przez 96 godzin, a komórki były zliczane i wyrażane jako proporcja kontrolnych hodowli traktowanych tylko podłożem. Pokazano dwa odrębne eksperymenty. ANOVA, test post-hoc Tukey a; * P <0,05 w porównaniu z HCT116.MUC1.A; P <0,05 w porównaniu z HCT116.MUC1.B; ** P <0,01 względem HCT116.MUC1.A; P <0,01 względem HCT116.MUC1.B; *** P <0,001 w porównaniu z HCT116.MUC1.A; P <0,001 w porównaniu z HCT116.MUC1.B. (E) Klon eksprymujący EM10 MUC1 (3 komórek HCT116 eksponowano na 200 jednostek / ml CDT przez 0 lub 24 godziny. Domena cytoplazmatyczna MUC1, p53 i jądra były barwione i badane za pomocą mikroskopii konfokalnej; strzałki wskazują kolokalizację MUC1 i p53 w pęcherzykach cytoplazmatycznych. CDT-null C. jejuni wykazuje niższą kolonizację żołądka, ale równoważną penetrację bariery jelitowej w Muc1. /. myszy in vivo. Wykazano, że oporny na chloramfenikol szczep C. jejuni 81-176 z delecją genu CDT-B (a CDT-B) powoduje mniej zapalenia w 4- i 8-tygodniowym modelu przewlekłego zakażenia w NF-kB p50. /. p65 + /. myszy (33). Dziki typ 81-176 i izogeniczny mutant. CDT-B inokulowano do Muc1 (3 /. i myszy Muc1 + / + i kolonizację tkanek układu żołądkowo-jelitowego i układowego analizowano po 48 godzinach (Figura 8A). Typu dzikiego 81-176 wykazały większą kolonizację tkanek układu żołądkowo-jelitowego i układowego Muc1. /. w porównaniu z myszami Muc1 + / +, weryfikując podatność Muc1. /. myszy na infekcję C. jejuni. W Muc1. /. myszy, znacznie niższe poziomy kolonizacji przez mutanta CDT-B zachodziły w żołądku, ale nie w jelicie. To odkrycie sugeruje, że w żołądku, w którym ekspresja Muc1 jest najwyższa, oporność związana z MUC1 na działanie CDT jest składnikiem konsekwentnie niższych poziomów kolonizacji C. jejuni u myszy typu dzikiego. Jednakże, mutant (3 CDT-B przekroczył barierę żołądkowo-jelitową w Muc1. /. myszy, co wskazuje, że działanie CDT nie jest głównym czynnikiem determinującym zakażenie układowe u myszy bez Muc1. Ilościowa ocena stężeń kaspaz aktywowanych związanych z apoptozą 3 i 7 w odcinku końcowego jelita krętego myszy zainfekowanych w doświadczeniu pokazanym na Figurze 8A ujawniła zwiększoną apoptozę u zakażonych myszy, z tendencjami do większej apoptozy w Muc1 (3). niż myszy Muc1 + / + zakażone C. jejuni typu dzikiego i niższa apoptoza u myszy zakażonych mutantem | CDT-B (Figura 8B). Różnice między zwierzętami w tych próbkach są zgodne z ogniskową aktywowanego barwienia kaspazą-3 obserwowaną przez immunohistochemię. Figura 8. CDT-B C. jejuni wykazuje niższą kolonizację żołądka i niższą apoptozę jelita, ale równoważną penetrację bariery jelitowej w Muc1. /. myszy in vivo. (A) Stężenia C. jejuni w tkankach układu żołądkowo-jelitowego i układowego Muc1. /. (y) i myszy Muc1 + / + (+) 129 / SvJ 48 godzin po doustnej inokulacji 105 ° C. jejuni szczep 81-176 (CDT +) i . CDT-B (CDT3). Oznaczać . SEM z CFU / g tkanki. Częstotliwość kolonizacji jest pokazana u podstawy każdego histogramu. ANOVA, test post-hoc Tukey a; * P <0,05; ** P <0,01. (B) Stężenia kaspaz 3 i 7 aktywowanych przez apoptozę są określane testem luminescencyjnym Caspase-Glo 3/7 w 2 połączonych segmentach 5-mm końcowego jelita krętego myszy w eksperymencie opisanym w A. Stosuje się skalę liniową, ponieważ poszczególne próbki wykazały liniowość rozcieńczenia. RFU, względne jednostki fluorescencji. Dyskusja Niniejsze opracowanie dostarcza nam, jak sądzimy, pierwszego empirycznego dowodu in vivo, że mucyny są kluczowym elementem obrony błony śluzowej przewodu pokarmowego przed patogenami. Zmiany w ekspresji Muc1 w przewodzie pokarmowym po zakażeniu bakteryjnym, wraz z dowodami, że C [przypisy: laboratorium pruszcz gdański, rezonans magnetyczny otwarty warszawa, porozumienie rodzicielskie wzór ] [przypisy: barszcz czerwony magdy gessler, rezonans magnetyczny puławy, szczepienie dur brzuszny ] [patrz też: barszcz czerwony magdy gessler, rezonans magnetyczny puławy, szczepienie dur brzuszny ]