Kwasy żółciowe obniżają poziom trójglicerydów poprzez szlak obejmujący FXR, SHP i SREBP-1c cd

Każda studzienka zawierała 64 ng reportera lucyferazy i 4 ng plazmidu ekspresyjnego P-galaktozydazy. Gdy wskazano, transfekowaliśmy 16 ng RXRa, 16 ng LXRa, 16 ng LRH-1, 32 ng plazmidu ekspresyjnego SHP lub odpowiadających im pustych wektorów ekspresyjnych. Po 6 godzinach inkubacji z kompleksami DNA-lipofektaminy, pożywkę transfekcyjną wymieniono na pożywkę z lub bez wskazanych ligandów. Ligandy dla LXR i RXR rozpuszczono w etanolu lub DMSO i dodano do komórek w DMEM uzupełnionym 10% surowicą z niedoborem lipoprotein. Aby zahamować aktywację SREBP-1c przez przetwarzanie, prowadząc do indukcji sprzężonej ekspresji SREBP-1c, pożywka stosowana w badaniu promotora SREBP-1c była również uzupełniona 10 .g / ml cholesterolu i .g / ml 25-hydroksycholesterolu. . Pomiary lucyferazy znormalizowano do aktywności (3-galaktozydazy. Hepatocyty. Hepatocyty izolowano z samców myszy typu dzikiego w wieku 8. 10 tygodni. Zwierzęta znieczulono CO2 i wątroby perfundowano 40 ml pożywki do perfuzji wątroby (Invitrogen), a następnie 30 ml pożywki do trawienia wątroby (Invitrogen), obie przy szybkości przepływu 5 ml / min. Izolowane hepatocyty ponownie zawieszono w DMEM uzupełnionym 20% (v / v) FCS, 100 jednostek / ml penicyliny i 100 jednostek / ml streptomycyny i umieszczono na płytkach powleczonych kolagenem IV o gęstości 1. 105 komórek / cm2. Po 4-godzinnej inkubacji w 37 ° C w atmosferze 5% CO2, medium zmieniono na DMEM uzupełnione 10% (v / v) FCS, 100 jednostek / ml penicyliny, 100 jednostek / ml streptomycyny, 0,5. M deksametazon (Sigma-Aldrich) i 0,4 .M insuliny (Sigma-Aldrich). Po 16 godzinach pożywkę zmieniono na pożywkę uzupełnioną CDCA i ligandami dla LXR i RXR. Po dodatkowej 18-godzinnej inkubacji komórki zebrano w celu izolacji RNA. Analiza poziomu ekspresji. Całkowity RNA ekstrahowano z zamrożonych próbek tkanek lub komórek przy użyciu zestawu RNeasy (QIAGEN, Courtaboeuf, Francja). cDNA zsyntetyzowano z całkowitego RNA za pomocą superpasmowego systemu pierwszej syntezy (Invitrogen) i losowych starterów heksamerowych. Pomiar PCR w czasie rzeczywistym poszczególnych cDNA przeprowadzono przy użyciu barwnika zielonego SYBR w celu zmierzenia tworzenia dupleksu DNA w systemie LightCycler (Roche Diagnostics, Meylan, Francja). Sekwencje użytych zestawów primerów są dostępne w Internecie pod adresem http://www-igbmc.u-strasbg.fr/Departments/Dep_V/Dep_VA/Publi/Paper.html. Analiza statystyczna. Wartości podano jako średnie. SE. Różnice statystyczne określano za pomocą testu ucznia lub ANOVA, a następnie testu końcowego Bonferroniego lub Dunnetta. Istotność statystyczna jest wyświetlana jako * (P <0,05) lub ** (P <0,01). Wyniki Kwas cholowy obniża poziom TG w surowicy u myszy KK-Ay. Aby zbadać działanie kwasów żółciowych obniżające poziom TG in vivo, najpierw zbadaliśmy wpływ karmienia CA na homeostazę TG u myszy KK-Ay. KK jest szczepem wsobnym, który rozwija cukrzycę typu 2 z jedynie łagodną otyłością, nawet po osiągnięciu dojrzałości (27). Wprowadzenie śmiercionośnej żółtej mutacji w genie agouti (Ay) (28) powoduje jawną cukrzycę typu 2 i masywną otyłość o stosunkowo późnym początku (29). Te myszy KK-Ay charakteryzują się silnie przedłużoną hiperinsulinemią, hiperglikemią i hiperlipidemią. W warunkach podstawowych wzrost TG jest jedynie umiarkowany (192. 16 mg / dl), ale może być dalej zwiększany przez dietę wysokotłuszczową (273. 14 mg / dl, Figura 1A). To zwiększenie poziomu TG w surowicy na diecie wysokotłuszczowej nie jest obserwowane u normalnych myszy C57BL / 6J (dane niepokazane i odniesienie 30), co czyni myszy KK-Ay unikalnym modelem do badania hipertriglicerydemii wywołanej dietą. Ponadto podwyższenie poziomu TG w surowicy jest progresywne i zależy od wieku myszy KK-Ay. W wieku 7 tygodni hipertriglicerydemia jest umiarkowana (192. 16 mg / dl, Figura 1A), podczas gdy w wieku 12 tygodni jest ciężka (453. 24 mg / dl, Figura 1C). Figura 1CA obniża TG w surowicy u myszy KK-Ay. (A) Przyjmowanie pokarmu myszy KK-Ay przez tydzień na dietach, jak opisano na figurze. Stężenia TG w surowicy, cholesterolu całkowitego (Chol) i FFA u myszy KK-Ay po tygodniu na różnych dietach (wiek 7 tygodni, n = 5). Kcal, kilokalorie; BW, masa ciała. (B) Profile lipoprotein TG i cholesterolu po chromatografii wykluczania wielkości puli surowicy od pięciu zwierząt. Kwantyfikacja TG VLDL jest pokazana w wstawce. (C) TG w surowicy w KK-Ay (u góry, wiek 12 tygodni, n = 4) i ob / ob (u dołu, wiek 12 tygodni, n = 4) myszy po 0, 1, 3 i 7 dniach leczenia syntetyczny agonista FXR GW4064. * P <0,05; ** P <0,01 na wszystkich rysunkach. Samcom myszy KK-Ay podawano normalną karmę dla dzieci lub wysokotłuszczową dietę z lub bez 0,5% CA przez tydzień. Diety zawierające CA były dobrze tolerowane, a spożycie pokarmu nie miało wpływu na tydzień (Figura 1A) i 3-tygodniowe badanie (nie pokazano) [hasła pokrewne: bytovia hpu, rezonans magnetyczny otwarty warszawa, barszcz czerwony magdy gessler ] [podobne: jak radzić sobie po rozstaniu, bytovia hpu, bytovia hpu pl ] [więcej w: jak radzić sobie po rozstaniu, bytovia hpu, bytovia hpu pl ]