Kwasy żółciowe obniżają poziom trójglicerydów poprzez szlak obejmujący FXR, SHP i SREBP-1c ad

Może to doprowadzić do zmniejszenia produkcji TG. Tutaj przedstawiamy dowody na poparcie pierwszej hipotezy i pokazujemy, że kwasy żółciowe, aktywując FXR, indukują ekspresję SHP. SHP następnie zakłóca ekspresję SREBP-1c przez hamowanie aktywności LXR i ewentualnie innych czynników transkrypcyjnych, które stymulują ekspresję SREBP-1c. Metody Materiały. Cholesterol, 22 (R) -hydroksycholesterol, 25-hydroksycholesterol, CA i CDCA otrzymano z Sigma-Aldrich (St. Quentin Fallavier, Francja). Plazmidy. pCMX-SHP otrzymano przez wstawienie produktu PCR odpowiadającego mysiemu cDNA SHP do wektora pCMX. pCMX. homolog receptora wątroby (pCMX-LRH-1) wytworzono przez wstawienie produktu PCR odpowiadającego cDNA LRH-1 myszy do pCMX. PCMX-LXR. wektor ekspresyjny był zgodny z opisem (10); receptora X retinoidu pSG5a. (wektor ekspresyjny pSG5-RXR .) był darem P. Chambon (Institut Clinique de la Souris, Illkirch, Francja). Plazmidy reportera lucyferazy promotora SREBP-1c wytworzono przez powielenie PCR fragmentów promotorowych odpowiadających sekwencjom znajdującym się pomiędzy p <1070 a <51 mysiego genu SREBP-1c. Produkt PCR poddano ligacji z wektorem podstawowym pGL3 (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Starter odwrotny stosowany dla każdego konstruktu promotorowego to 5a-CTTCCGCGCCGATTTCACCTG-3 .. Różne startery do przodu stosowane dla każdego konstruktu są następujące: pSREBP-1c1070-Luc (5a-ACCCCTCAGACTGTGTGAGT-3a), pSREBP-1c571-Luc (5a-CTA GCTAGATGACCCTGCACCACCAA-3 .), pSREBP-1c327-Luc (5 Y-TTGCCTGTGCGGCAGGGGTTGGGACGA-3a), pSREBP-1c276-Luc (5a-CGCGCTGGCGCAGACGCGGTTAAA-3a) i pSREBP-1c151-Luc (5a-CTGCTGATTGGCCATGTGCGCTCA-3a). Startery były zakończone albo miejscem KpnI (do przodu), albo miejscem Bglll (do tyłu). Elementy odpowiedzi LXR w pSREBP-1c324-Luc zmutowano do analizy promotora za pomocą zestawu do szybkiej mutagenezy ukierunkowanego na szybką zmianę (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA). Wszystkie konstrukty zostały zweryfikowane przez analizę sekwencji. Zwierząt. Samce myszy C57BL / 6J, KK-Ay i ob / ob (C57BL / 6J), w wieku 6. 10 tygodni, otrzymano od Elevage Janvier (Le Genest St. Isle, Francja), CLEA Japan Inc. (Tokio, Japonia) oraz The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). Wszystkie myszy utrzymywano w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (23 ° C) z 12-godzinnym cyklem światło / ciemność i uzyskano swobodny dostęp do pożywienia i wody. Protokoły badań zostały zatwierdzone przez komisje przeglądowe instytucji. Masę ciała i jedzenie przyjmowano co drugi dzień. Dietę kontrolną i wysokotłuszczową otrzymano z UAR (Villemoisson sur Orge, Francja). Dieta kontrolna (EQ12310) zawierała 16,8% białka, 73,5% węglowodanów i 4,8% tłuszczu, podczas gdy dieta bogata w tłuszcze (EQ / D12309) zawierała 23,0% białka, 35,5% węglowodanów i 35,9% tłuszczu. W celu leczenia kwasów żółciowych myszy otrzymywały diety o 0,5% (w / w) CA. Myszy głodzono 4 godziny przed pobraniem krwi do późniejszych pomiarów lipidów, a tkanki do izolacji RNA, pomiarów lipidów i histologii. Mężczyzna SHP. /. Myszom i młodym towarzyszom SHP + / + (szczep mieszany C57 / BL6-A129 / SvJ) przez 8 tygodni karmiono dietę CA tak, jak opisano powyżej, lub poddano zgłębianiu z GW4064 rozpuszczonym w oleju kukurydzianym w 30 mg / kg (23). Mężczyzna typu dzikiego i LXR. / /. myszy (szczep mieszany C57 / BL6-A129 / SvJ, pozycja 10) 10. 14 tygodni karmiono dietą w proszku (Harlan Teklad 7001, Madison, Wisconsin, USA) i, gdy to wskazano, zmieszano z 0,5% CA. Zawiesinę T0901317 przygotowaną w 1% roztworze karboksymetylocelulozy zastosowano do sondowania przy 30 mg / kg. Myszy KK-Ay i ob / ob na diecie kontrolnej codziennie poddawano zastrzykowi dootrzewnowemu przez tydzień za pomocą GW4064 przygotowanego w 1% roztworze karboksymetylocelulozy przy 10 mg / kg. Pomiary lipidów i testy czynności wątroby. Stężenie cholesterolu całkowitego w surowicy, TG i cholesterolu lipoproteinowego oraz profil TG mierzono zgodnie z opisem (24, 25). W celu pomiaru TG wątroby i zawartości cholesterolu, wątrobę homogenizowano w chloroformie / metanolu (2: v / v) przy użyciu szlifierki tkanek Polytron (Kinematica AG, Luzern, Szwajcaria). Ekstrakty lipidowe przygotowano klasyczną metodą Folcha. Ekstrakty wysuszono w strumieniu N2 i ponownie zawieszono w izopropanolu. W przypadku pomiarów in vivo wytwarzania VLDL TG myszom wstrzyknięto Tyloxapol (Sigma-Aldrich) (500 .g / g masy ciała), po czym próbki krwi pobrano we wskazanych punktach czasowych (26). Hodowla komórkowa, przejściowa transfekcja i testy lucyferazy. Linię komórek wątroby wątrobiaka szczura McA-RH7777 uzyskano z ATCC (Manassas, VA, USA). Komórki hodowano w 37 ° C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 / 95% powietrza. Transfekcje przeprowadzono na 96-studzienkowych płytkach przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francja) [hasła pokrewne: jak przygotować bakłażana, szczepienie dur brzuszny, bytovia hpu ] [patrz też: zielone koktajle przepisy, jak przygotować bakłażana, największa wagina na świecie ] [podobne: zielone koktajle przepisy, jak przygotować bakłażana, największa wagina na świecie ]