Identyfikacja ludzkiego współczynnika konduktów 1 z moczem jako nowego inhibitora wzrostu kryształów szczawianu wapnia czesc 4

Analizę Western blot przeprowadzono stosując monoklonalne przeciwciało anty-TFF1 i rekombinowany TFF1 (2 (ig) służył jako kontrola pozytywna. (A) Walidację przeprowadzono dla różnych podfrakcji, głównej frakcji X i surowej anionowej próbki otrzymanej od 2 zdrowych zdrowych dawców (DEAE). (B) Walidacja została przeprowadzona dla frakcji X wyizolowanej od 4 zdrowych dawców (N1aN4), co wskazuje na stałą ekspresję TFF1 w moczu w prawidłowym ludzkim moczu. Na każdej ścieżce załadowano 30 .g całkowitego białka. Brak znanych kamiennych inhibitorów w frakcji TFF1 w moczu. Ponieważ oczyszczanie TFF1 w moczu w obecnym badaniu wykorzystywało metodologię podobną do tej stosowanej wcześniej do oczyszczania innych inhibitorów kamiennych, w szczególności nephrocalcin i uropontin (24, 31), przeprowadziliśmy analizy Western blot frakcji X w celu zbadania, czy nephrocalcin, uropontin, bikunina i białko Tamm-Horsfall były obecne lub zanieczyszczone w oczyszczonej frakcji TFF1 z moczu. Figura 6 wyraźnie pokazuje, że te kamienne inhibitory wykryto tylko w całkowitej anionowej frakcji białka, nie w oczyszczonej frakcji X, podczas gdy TFF1 był obecny zarówno w frakcji X, jak i całkowitej anionowej frakcji białkowej. Figura 6 Czystość izolowanego układu TFF1 z moczem. Przeprowadzono analizy metodą Western blot oczyszczonego białka w celu zbadania, czy nephrocalcin, uropontin, bikunin i białko Tamm-Horsfall (THP) były obecne jako zanieczyszczenia w oczyszczonej frakcji TFF1 z moczu. Dane wyraźnie pokazują, że te kamienne inhibitory wykryto tylko w całkowitej anionowej frakcji białkowej, nie w oczyszczonej frakcji X, podczas gdy TFF1 był obecny zarówno w frakcji X, jak i całkowitej anionowej frakcji białkowej. Charakterystyka hamującej aktywności TFF1 w moczu przeciwko wzrostowi kryształów CaOx. Aktywność hamowania wzrostu kryształów CaOx. TFF1 oczyszczonego z ludzkiego moczu została porównana z aktywnością znanych białkowych inhibitorów wzrostu kryształów. Nephrocalcin, silny inhibitor wzrostu kryształów CaOx, zastosowano jako kontrolę pozytywną, podczas gdy lizozym, białko bez aktywności wiązania Ca2 +, zastosowano jako kontrolę ujemną. Figura 7A pokazuje względne aktywności hamujące lizozymu, białka Tamm-Horsfall, nephrocalcin i TFF1 z moczu. Zgodnie z oczekiwaniami nephrocalcin miał najsilniejszą aktywność hamującą wzrost kryształów CaOx, co było zgodne z danymi opisanymi wcześniej (32, 33). Interesujące jest to, że hamująca aktywność TFF1 w moczu była bardzo podobna do aktywności nephrocalcin (36,1%. 2,0% w porównaniu z 39,8%. 1,9% względnej aktywności hamującej), gdy użyto równej ilości białka (3 (ig). Białko Tamm-Horsfall miało znacznie słabszą aktywność hamującą w porównaniu z nephrocalcin i TFF1 z moczu, chociaż całkowita ilość białka Tamm-Horsfall użytego w tym doświadczeniu była znacznie większa (50 .g, około 16 razy więcej niż nephrocalcin i TFF1 z moczu). Figura 7B pokazuje, że hamująca aktywność TFF1 w moczu była zależna od dawki. Figura 7 Charakteryzacja hamującej aktywności TFF1 w moczu wobec wzrostu kryształów CaOx. (A) Aktywność hamująca wzrost kryształów CaOx w TFF1 w moczu była podobna do aktywności nephrocalcyny, gdy użyto równej ilości białka i była silniejsza niż w przypadku białka Tamm-Horsfall, chociaż zastosowano mniejszą ilość TFF1. Zastosowano lizozym jako kontrolę negatywną. (B) Aktywność hamująca TFF1 w moczu była zależna od dawki. (C) Aktywność hamująca rekombinowanego TFF1 była również zależna od dawki i porównywalna z tą dla TFF1 z moczu. Przy równej ilości użytego białka aktywność hamująca rekombinowanego TFF3 była znacząco mniejsza (około 2-krotnie) niż aktywność rekombinowanego lub moczowego TFF1. (D) Inkubacja układu moczowego TFF1 z przeciwciałem anty-C-terminalnym TFF1 znacząco zmniejszała aktywność TFF1 hamującą wzrost krystaliczny CaOx. Działanie neutralizujące anty-C-terminalnego przeciwciała TFF1 było silniejsze niż działanie anty-N-terminalnego przeciwciała TFF1. Dane te wskazują, że koniec C TFF1, który zawiera liczne reszty kwasu glutaminowego, jest szczególnie ważny w pośredniczeniu w hamującej funkcji TFF1 funkcji wzrostu wzrostu CaOx. * P <0,001. n = 4 na próbkę. Aby potwierdzić, że aktywność hamująca wzrost kryształów CaOx frakcji X była specyficzna dla TFF1, badano aktywność hamowania wzrostu kryształów CaOx. Rekombinowanych TFF1 i TFF3, innego członka z rodziny czynników koniczylowych. Figura 7C pokazuje, że aktywność hamowania wzrostu kryształów CaOx zrekombinowanego TFF1 była zależna od dawki i podobna do tej z oczyszczonego TFF1 z moczem, gdy użyto tej samej ilości białka. Aktywność hamująca rekombinowanego TFF3 była w przybliżeniu o połowę mniejsza niż rekombinowanego TFF1 i TFF1 z moczu. Dalszą charakterystykę hamującej aktywności TFF1 w moczu wobec wzrostu kryształów CaOx przeprowadzono stosując poliklonalne przeciwciała anty-N-końcowe i anty-C-TFF1 w celu zneutralizowania hamującej aktywności TFF1. [przypisy: ubezpieczenia zdrowotne prywatne, szpital powiatowy mikołów, zielone koktajle przepisy ] [przypisy: laboratorium pruszcz gdański, barszcz czerwony magdy gessler, rezonans magnetyczny puławy ] [podobne: laboratorium pruszcz gdański, barszcz czerwony magdy gessler, rezonans magnetyczny puławy ]