Identyfikacja ludzkiego współczynnika konduktów 1 z moczem jako nowego inhibitora wzrostu kryształów szczawianu wapnia cd

Tą połączoną frakcję następnie oddzielono przez chromatografię anionowymienną Q z Wymianą z gradientem 0. 0,5 M NaCl (rozdział ładunku). Frakcję X oddzielono dalej przez chromatografię anionowymienną na kolumnie Resource Q. Związane białka eluowano liniowym gradientem 0. 0,5 M NaCl. Wszystkie podfrakcje zebrano i zbadano pod kątem aktywności hamującej wzrost kryształów CaOx. Tylko 2 podfrakcje, a mianowicie podfrakcje X1 i X2, miały silną aktywność hamowania wzrostu kryształów CaOx, co wskazuje, że zawierały one hamującą aktywność całej frakcji X. Białka w tych 2 podfrakcjach zostały dodatkowo oddzielone przez 12% SDS-PAGE i białko. prążek o tej samej pozornej masie cząsteczkowej (od 6 do 14 kDa) został zwizualizowany w obu próbkach (rysunek 3). Podfrakcje X1. i X2. odpowiadał 2 podfrakcjom, wyizolowanym z innego preparatu innego dawcy, aby potwierdzić powtarzalność naszych metod oczyszczania. Figura 3SDS-PAGE oczyszczonego białka o aktywności hamującej wobec wzrostu kryształów CaOx. Przeprowadzono chromatografię anionowymienną Q z wymywaniem liniowym gradientem 0. 0,5 M w celu oddzielenia białek we frakcji X. Z wszystkich podfrakcji 2 miały silną aktywność hamującą wobec wzrostu kryształów CaOx (podfrakcje X1 i X2) i zostały rozdzielone w żel 12% SDS-PAGE z barwnikiem Coomassie Brilliant Blue R-250 (30 .g na ścieżkę). Podfrakcje X1. i X2. odpowiadały 2 podfrakcjom wyizolowanym od drugiego dawcy w celu potwierdzenia powtarzalności naszych metod oczyszczania. Standardowe standardowe znaczniki. Masowa identyfikacja spektrometryczna ludzkiego TFF1. Prążki białkowe wykrywane w podfrakcjach X1, X2, X1a i X2a wycięto, trawiono trypsyną w żelu i zidentyfikowano za pomocą wspomaganej matrycą desorpcji / jonizacji laserowej. czasu lotu (MALDI-TOF) MS i jonizacji przez elektrorozpylanie. kwadrupolowe. TOF tandemowe MS (ESI-Q-TOF MS / MS). Figura 4, A i B ilustruje spójne wyniki uzyskane z różnych podfrakcji białka. Korzystając z wyszukiwarki MASCOT (http://www.matrixscience.com), dane MALDI i ESI-Q-TOF uzyskane ze wszystkich 4 podfrakcji zostały znacząco dopasowane do ludzkiego 1pS2 (gi | 2392506, 60 reszt), rekombinowanej postaci ludzki TFF1 (Figura 4, C i D). Wynik dopasowania był najwyższy dla rekombinowanego ludzkiego TFF1 zamiast dla natywnego ludzkiego TFF1, ponieważ ludzki TFF1 został zgłoszony do baz danych jako forma prekursorowa (84 aminokwasy), a nie jako dojrzała postać (60 aminokwasów). Jedyna różnica między rekombinowanym TFF1 (1pS2) a natywną dojrzałą postacią ludzkiego TFF1 występuje w pięćdziesiątej ósmej reszcie (seryna w 1pS2 w porównaniu z cysteiną w natywnym TFF1) (30). Nie zidentyfikowano C-końcowego trypsynowego peptydu natywnego TFF1 w żadnej z podfrakcji białka ludzkiego moczu (Figura 4D). Jest tak prawdopodobnie dlatego, że C-końcowy trypsynowy peptyd TFF1 można zidentyfikować tylko w trybie jonów ujemnych. Z tego względu zidentyfikowaliśmy natywną dojrzałą postać ludzkiego TFF1 w podfrakcjach białka prawidłowego ludzkiego moczu, które zawierają największą aktywność hamującą wzrost kryształów CaOx. TFF1 jest małym wydzielanym białkiem, wyrażanym głównie w błonie śluzowej żołądka i uważa się, że odgrywa ważną rolę w ochronie śluzówki. Nie było to związane wcześniej z prawidłową czynnością nerek. Rysunek 4 Identyfikacja TFF1 przez MALDI-TOF MS i ESI-Q-TOF MS / MS. (A i B) dane spektrometryczne MALDI uzyskane z podfrakcji X1 i X2. (C) Widma mas tandemowe otrzymane z ESI-Q-TOF MS / MS były w znacznym stopniu dopasowane do peptydu AQTETCTVA ludzkiego 1pS2 (gi | 2392506) lub TFF1. Jony fragmentów [y (2), y (3) itd.] Wygenerowane z analiz MS / MS zostały ponumerowane zgodnie z ich położeniem z C-końca. (D) Korzystając z wyszukiwarki MASCOT, masy peptydów otrzymane ze wszystkich podfrakcji (X1, X2, X1a i X2a) były znacząco dopasowane do 1pS2, rekombinowany ludzki TFF1, a zidentyfikowane reszty otrzymane z MS / MS znakowano. Walidacja danych spektrometrycznych mas. Aby potwierdzić tożsamość ludzkiego TFF1 w podfrakcjach X1, X2, X1a i X2. wyizolowany od 2 normalnych dawców, przeprowadziliśmy analizę Western blot przy użyciu monoklonalnego przeciwciała anty-TFF1. Figura 5A ilustruje, że Western blot zidentyfikował immunoreaktywne pasmo białka TFF1 we wszystkich 4 podfrakcjach, w pierwotnej frakcji X, i w surowej próbce anionowej, która migruje z tą samą pozorną masą cząsteczkową jak rekombinowany TFF1. Wyniki te potwierdziły identyfikację białka przez MALDI-TOF MS i ESI-Q-TOF MS / MS i wskazały, że białko hamujące wzrost Ca2x. w frakcji X i jego podfrakcjach jest TFF1. Obecność TFF1 w moczu potwierdzono również u 4 innych zdrowych osób (Figura 5B). Figura 5 Weryfikacja ekspresji TFF1 w moczu
[więcej w: jak przygotować bakłażana, leczenie zębów w narkozie, największa wagina na świecie ]
[patrz też: bytovia hpu, bytovia hpu pl, kamil juraszek ]
[hasła pokrewne: bytovia hpu, bytovia hpu pl, kamil juraszek ]