Identyfikacja ludzkiego współczynnika konduktów 1 z moczem jako nowego inhibitora wzrostu kryształów szczawianu wapnia ad 9

Aktywność hamującą wobec wzrostu kryształów CaOx mierzono za pomocą zaszczepionego testu zubożenia w roztwór opisanego uprzednio przez Nakagawę i współpracowników (32). W skrócie, krystaliczne monohydrat CaOx dodano do roztworu zawierającego mM CaCl2 i mM szczawianu sodu (Na2C2O4). Reakcja CaCl2 i Na2C2O4 z nasionami kryształu prowadziłaby do osadzania się CaOx (CaC2O4) na powierzchniach kryształów, zmniejszając w ten sposób wolny szczawian wykrywalny przez spektrofotometrię przy A 214 nm. Kiedy do tego roztworu dodaje się białko, zmniejszanie się wolnych jonów szczawianowych będzie się zmniejszać, jeśli białko hamuje wzrost kryształów CaOx. Szybkość redukcji wolnego szczawianu obliczono stosując wartość wyjściową i wartość po 30-sekundowej inkubacji z białkiem lub bez białka. Względną aktywność hamującą obliczono następująco:% Względna aktywność hamująca = [(CsS) / C] x 100, gdzie C jest stopniem redukcji wolnego szczawianu bez żadnego białka, a S jest szybkością redukcji wolnego szczawianu z białko testowe. Aby porównać hamującą aktywność naszego oczyszczonego białka z innymi, zastosowano lizozym (Sigma-Aldrich) jako kontrolę negatywną, a jako kontrolę pozytywną zastosowano nephrocalcin (University of Chicago Pritzker School of Medicine). Badano również białko Tamm-Horsfall (University of Chicago Pritzker School of Medicine). Rekombinowane TFF1 i TFF3 (University of Newcastle) zastosowano do potwierdzenia specyficzności hamującej aktywności oczyszczonego białka. Aby zbadać, czy specyficzne miejscowo przeciwciała anty-TFF1 zmniejszają aktywność hamującą wzrost kryształów CaOx białka w końcowych 2 podfrakcjach (które zostały zidentyfikowane jako TFF1 w moczu) i przewidują miejsce funkcjonalne TFF1 w moczu, 0,4 .g anty-N -terminalne i anty-C-końcowe przeciwciała poliklonalne specyficzne wobec TFF1 inkubowano z próbką białka o masie 8 g w 37 ° C przez godzinę przed badaniem za pomocą testu do pomiaru aktywności hamującej wobec wzrostu kryształów CaOx. Aby zbadać, czy TFF1 w moczu na poziomach fizjologicznych może hamować wzrost kryształów CaOx, oceniano TFP1 w moczu w stężeniach 7, 70 i 700 ng / ml. Test hamowania prowadzono przez dłuższy czas (do godziny) w celu zbadania kinetyki funkcji TFF1 na jej poziomach fizjologicznych i do symulacji długotrwałego efektu oddziaływania między kryształami i niskiego stężenia białka podczas normalnego stanu fizjologicznego. Dane kinetyki przedstawiono jako szybkość wolnego zubażenia szczawianu w każdym stanie. Pomiar poziomów TFF1 w moczu za pomocą testu ELISA. Stężenia TFF1 w moczu 30 zdrowych osób zdrowych i 23 pacjentów z idiopatycznym kamicą nerkową CaOx zmierzono za pomocą testu ELISA. Początkowo anionowe białka moczowe izolowano stosując adsorpcję DEAE. 96-studzienkową płytkę (Nunc; Apogent) powleczono równymi ilościami wyizolowanych anionowych białek DEAE (40 .g / studzienkę) w 4 ° C przez noc, a niespecyficzne wiązania zablokowano 5% BSA w PBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. godziny. Płytkę przemyto 3 razy 0,05% Tween-20 w PBS. Przeciwciałem anty-N-terminalnym TFF1 (1: 100 rozcieńczonym 0,1% BSA w PBS) użyto jako głównego przeciwciała. Po inkubacji z pierwszorzędowym przeciwciałem przez godzinę płytkę przemyto 3 razy 0,05% Tween-20 w PBS i inkubowano z króliczą anty-kozą IgG skoniugowaną z HRP (1: 1000 rozcieńczoną 0,1% BSA w PBS) przez godzinę. w ciemności. Reaktywne białko wykrywano przez inkubację z o-fenylenodiaminą (Sigma-Aldrich) przez 15 minut i oznaczano ilościowo przez pomiar absorbancji przy długości fali ~ 492 nm przy użyciu czytnika mikropłytek ELISA (Anthos HTII, Anthos Labtec Instruments GmbH). Rekombinowany TFF1 zastosowano do skonstruowania krzywej standardowej, a BSA zastosowano jako kontrolę ujemną. Statystyka. Aby porównać procent względnej aktywności hamującej różnych próbek i określić różnice poziomów TFF1 w moczu u twórców kamienia CaOx w porównaniu z normalnymi kontrolami, zastosowano niesparowany dwustronny test Studenta. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. Dane zostały podane jako średnie. SD. Podziękowania Dziękujemy Sutha Sangiambut, Duangporn Chuawatana, Kanittarowi Srisookowi, Grahamowi W. Taylorowi i Dinah Rahman za ich pomoc techniczną; Sombat Borwornpadungkitti, Wattanachai Susangrut, Wipada Chaowagul i Santi Rojsatapong w celu zbierania moczu; oraz Jisnuson Svasti, Chantragan Srisomsap, Polkit Sangvanich, Pa-thai Yenchitsomanus, Somkiat Vasuvattakul i Sumalee Nimmannit za ich nieocenioną radę i wsparcie. Badanie to zostało wsparte przez Tajski Fundusz Badawczy (Senior Research Scholar Program, grant RTA4680017, P. Malasit) oraz Wellcome Trust and Cancer Research, Zjednoczone Królestwo (do FEB Maj i BR Westley). V. Thongboonkerd jest wspierany przez Siriraj Preclinic Grant i Siriraj Foundation (D 2362: Surapongchai Fund). Przypisy Prida Malasit i Visith Thongboonkerd w równym stopniu przyczyniły się do tej pracy. Niestandardowe skróty: CaOx, szczawian wapnia; Cr, kreatynina; dI, dejonizowany; ESI-Q-TOF, jonizacja przez elektrorozpylanie – kwadrupol-TOF; MALDI, laserowa desorpcja / jonizacja wspomagana matrycą; MS, spektrometria masowa; MS / MS, tandem MS; TFF1, współczynnik koniczyny 1; TOF, czas przelotu. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[podobne: błonnik witalny opinie lekarzy, szpital powiatowy mikołów, rezonans magnetyczny puławy ]
[podobne: zielone koktajle przepisy, jak przygotować bakłażana, największa wagina na świecie ]
[podobne: zielone koktajle przepisy, jak przygotować bakłażana, największa wagina na świecie ]