Identyfikacja ludzkiego współczynnika konduktów 1 z moczem jako nowego inhibitora wzrostu kryształów szczawianu wapnia ad 8

Zawiesinę przesączono przez filtr ze spiekanego szkła i placek przemyto 0,01 M Tris-HCl w 0,05 M NaCl (pH 7,3), aż przesącz stał się bezbarwny. Zaadsorbowane białka wymywano następnie l 0,01 M Tris-HCl w 0,6 M NaCl (pH 7,3). Następnie, eluat dializowano wobec 12 l wody dl przez 24 godziny dwa razy, a następnie liofilizowano w celu zmniejszenia objętości próbki i zatężenia białek. Filtracja żelowa za pomocą kolumny HiLoad 16/60 Superdex 75 (separacja wielkości). Po adsorpcji DEAE, rozdział wielkości anionowych białek przeprowadzono za pomocą kolumny filtracyjnej HiLoad 16/60 Superdex 75 (Amersham Biosciences), stosując bufor zawierający 0,15 M NaCl i 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) jako bufor roboczy. Szybkość przepływu wynosiła ml / min, a absorbancję eluatu monitorowano przy A 214 nm. Powstałe frakcje badano pod kątem aktywności w teście hamowania wzrostu kryształów CaOx. Osiem kolejnych frakcji o najniższym OD przy ~ 214 nm. ale z najwyższą aktywnością hamującą wzrost kryształów CaOx. połączono i nazwano frakcję X. Po dializie z wodą dl frakcja X została liofilizowana w celu zmniejszenia jej objętości. Chromatografia anionowymienna z użyciem kolumny Resource Q z elucją z gradientem liniowym (separacja ładunku). Frakcję X oczyszczono metodą chromatografii anionowymiennej stosując kolumnę Resource Q (Amersham Biosciences). Kolumnę przepuszczono w 0,02 M Tris-HCl (pH 8,0) przy szybkości przepływu ml / min, a związane białka wymyto liniowym gradientem 0. 0,5 M NaCl. Wszystkie uzyskane podfrakcje testowano pod względem aktywności w teście hamowania wzrostu kryształów CaOx i zebrano 2 podfrakcje o silnej aktywności hamującej wobec wzrostu kryształów CaOx (podfrakcje X1 i X2). Białko w podfrakcjach X1 i X2 rozdzielono przez SDS-PAGE i zidentyfikowano przez MS. Sole zostały oczyszczone z oczyszczonego białka przed analizą; próbkę dializowano za pomocą wody dl i liofilizowano w celu zmniejszenia objętości. SDS-PAGE i wizualizacja pasm białka. Porcje stężonych podfrakcji X1 i X2 zmieszano z buforem do próbek Laemmli i ogrzewano w 95 ° C przez 10 minut. Próbki (30 .g na ścieżkę) następnie rozdzielono w gęstym na 0,75 mm, 12% żelu SDS-poliakryloamidowym, stosując aparat do pionowej elektroforezy (ATTO Corp.). Białka następnie wizualizowano przez barwienie za pomocą Coomassie Brilliant Blue R-250 (Fluka). Identyfikacja białka przez MALDI-TOF MS i ESI-Q-TOF MS / MS. Wizualizowane prążki białkowe wycięto i poddano trawieniu trypsyną w żelu i identyfikacji przez MALDI-TOF MS i ESI-Q-TOF MS / MS (Imperial College London). Dopasowanie peptydów przeprowadzono przy użyciu wyszukiwarki MASCOT (http://www.matrixscience.com) przy założeniu, że peptydy były monoizotopowe, karbamidometylowane przy resztach cysteiny i utlenione w resztach metioniny. Tolerancja masy wynosiła 120 części na milion i tylko maksymalne rozszczepienie było dozwolone dla dopasowania peptydu. Mowse oparty na prawdopodobieństwie MOWSE (MOlecular Weight SEarch) został obliczony przy użyciu wzoru [. 10log (P)], gdzie P było prawdopodobieństwem, że obserwowany mecz był przypadkowym zdarzeniem. Wyniki dopasowania peptydów. 75 (dla danych MALDI) i indywidualne oceny jonów. 50 (dla danych Q-TOF lub MS / MS) uznano za znaczące trafienia. Przeciwciała anty-TFF1. Mysie monoklonalne przeciwciało anty-TFF1 hodowano w laboratorium FEB May i stosowano do walidacji ekspresji TFF1 przez Western blotting. W celu scharakteryzowania hamującej aktywności TFF1 w moczu przeciwko wzrostowi kryształu CaOx, specyficzny dla anty-N terminal TFF1 (nr katalogowy sc-22501, Santa Cruz Biotechnology Inc.) i specyficzny dla anty-C TFF1 (numer katalogowy sc -22502; Santa Cruz Biotechnology Inc.) zastosowano kozie przeciwciała poliklonalne. Western blotting. Po SDS-PAGE rozdzielone białka przenoszono na błonę nitrocelulozową stosując pół-suche urządzenie do przenoszenia (Amersham Biosciences) przy 20 V przez 30 minut. Niespecyficzne wiązanie blokowano 5% mlekiem w PBS w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie membrany inkubowano z mysim monoklonalnym anty-TFF1, króliczym poliklonalnym anty-nephrocalcin (University of Chicago Pritzker School of Medicine), owczym poliklonalnym anty-Tamm-Horsfall (nr katalogowy AB733, Chemicon International), szczurzym monoklonalnym anty-uropontinem. (numer katalogowy: MAB 3057, Chemicon International) lub przeciwciało poliklonalne anty-bikunina (nr katalogowy sc-21598; Santa Cruz Biotechnology Inc.) w 4 ° C przez noc. Przeciwciała wtórne specyficzne dla gatunku skoniugowane z HRP badano następnie w temperaturze pokojowej przez godzinę. Reaktywne białka wizualizowano za pomocą substratu chemiluminescencyjnego 3,3-diaminobenzydyny (Sigma-Aldrich) lub SuperSignal West Pico (Pierce Biotechnology Inc.). Test do pomiaru aktywności hamującej białka względem wzrostu kryształów CaOx
[więcej w: zielone koktajle przepisy, kamil juraszek, dlaczego ziewanie jest zaraźliwe ]
[przypisy: dlaczego ziewanie jest zaraźliwe, bytovia bytów, rezonans magnetyczny otwarty warszawa ]
[więcej w: dlaczego ziewanie jest zaraźliwe, bytovia bytów, rezonans magnetyczny otwarty warszawa ]