Hepatic Niemann-Pick C1 Jak 1 reguluje stężenie cholesterolu w żółci i jest celem ezetymibu ad 9

Samce myszy w wieku 8. 10 tygodni karmiono ad libitum (10 g / d) syntetyczną niskotłuszczową dietą o niskiej zawartości cholesterolu (10% energii jako tłuszczu wzbogaconego w palmę, 0,015% cholesterolu, wag./wag.) Lub niską -fata, dieta bogata w cholesterol (10% energii jako tłuszcz wzbogacony w palm, 0,2% cholesterolu, w / w). Krew pęcherzyka żółciowego i krew zebrano od myszy poszczących w przybliżeniu 4 godziny, które były karmione dietą przez 21 dni. Wątrobę usunięto, zważono i szybko zamrożono w ciekłym azocie. Stężenie lipidów w wątrobie i osoczu zmierzono zgodnie z wcześniejszym opisem (47, 48). W celu określenia rozkładu cholesterolu lipoprotein osocza, zebrano równe objętości osocza od myszy 6. 7 i klasy lipoprotein rozdzielono metodą chromatografii żelowej, jak opisano poprzednio (30). W celu analizy stężenia lipidów w żółciach zmierzoną objętość (5. 10. L) żółci ekstrahowano za pomocą 2: CHCl3 / MeOH w obecności 10. G 5. -Cholestanu. Fazę organiczną analizowano pod kątem zawartości cholesterolu za pomocą chromatografii gaz-ciecz (30) i zawartości PL przy użyciu zestawu do oznaczania enzymatycznego fosfolipidów B (Wako) (30, 47). Fazę wodną analizowano pod kątem zawartości BA, stosując test enzymatyczny wykorzystujący dehydrogenazę hydroksysteroidową (30). Oznaczanie zawartości apolipoprotein w lipoproteinach osocza. Osocze zebrano z myszy WT 6 i 4 L1-Tg112 karmionych dietą 0,2% cholesterolu przez 21 dni. Całkowite lipoproteiny osocza wyizolowano przez dostosowanie gęstości osocza do 1,225 g / ml za pomocą KBr, a następnie wirowanie plazmy w ultrawirówce Optima MAX-E (Beckman) przy 356,000 g przez 3 godziny w 15 ° C z zastosowaniem rotora TLA 120.2. Całkowitą frakcję lipoproteiny rozdzielono metodą chromatografii na żelu stosując kolumnę Superose 6 (Amersham Pharmacia Biotech) z szybkością przepływu 0,5 ml / min. Frakcje zbierano w 1-minutowych odstępach podczas etapu chromatografii. Równe objętości (20. L) frakcji 19. 32 zmieszano z 6. L 20% SDS / 100 mM DTT, po czym 6. L 5 x bufor próbki (250 mM Tris, pH 6,8, 25% glicerol i 0,25% błękit bromofenolowy). Równą objętość każdej frakcji oddzielono na żelu gradientowym 4% ~ 12% poliakryloamidu (Cambrex). Jeden zestaw żeli zabarwiono 0,02% błękitem Coomassie w 30% MeOH / 10% lodowatego kwasu octowego. Białko z drugiego zestawu żeli przeniesiono na membrany nitrocelulozowe, które następnie zablokowano 5% odtłuszczonym, wysuszonym mlekiem rozpuszczonym w buforze immunoblotowym (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 i 0,05% Tween-20). Błony badano za pomocą .g / ml koziego antyludzkiego apoB IgG (Academy Bio-Medical Co.) w buforze do inkubacji (3% niesuszone, wysuszone mleko, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,2% Tween -20 i 0,5 mM MgCl2), przemywano buforem do immunoblottingu i sondowano rozcieńczeniem 1: 5,000 IgG anty-koziej skoniugowanej z HRP (Sigma-Aldrich) w buforze do inkubacji. Błony przemyto buforem do immunoblottingu i potraktowano SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce). Wizualizację apoB48 i apoB100 uzyskano przez poddanie membran działaniu folii X-Omat XLS-1 (Kodak). Kwantyfikacja apoE w osoczu. Osocze poddawano immunoblottingowi jak opisano powyżej za pomocą króliczej surowicy anty-szczurzego apoE (dostarczonej przez J. Herz, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, USA). Plamy oznaczono ilościowo metodą densytometrii. Analiza składu chemicznego procentu lipoprotein i składu FA CE. Po frakcjonowaniu za pomocą chromatografii z wykluczaniem rozmiarów połączono frakcje reprezentujące LDL, ERL i HDL. Całkowite lipidy wyekstrahowano z próbek, jak opisano powyżej dla żółci, i zastosowano testy enzymatyczne do określenia stężeń TC, FC, TG i PL próbek. Stężenia CE obliczono, mnożąc różnicę mas między TC i FC przez 1,67. Stężenia białka dla próbek oznaczono za pomocą testu Lowry ego (49). Procentowy skład chemiczny obliczono dzieląc stężenie każdego składnika przez sumę stężeń dla wszystkich składników. Kompozycję FA CE znalezioną na LDL, ERL i HDL analizowano jak opisano wcześniej (31). Wydzielanie lipidów żółciowych po leczeniu ezetymibem. Po karmieniu dietą 0,015% cholesterolu przez 18 dni, samcom myszy podawano żołądek codziennie w dniach 18. 21 albo za pomocą 0,3 mg ezetymibu zawieszonego w 100. L 0,4% metylocelulozy lub 100. L 0,4% metylocelulozy osobno (nośnik). W dniu 19 myszy umieszczono w klatkach z podłogą z drutu i pojedynczo umieszczono w celu zebrania stolca przez 3 dni i zmierzono obojętne wydalanie sterolu w kale, jak opisano wcześniej (47). Myszy utrzymywano na tej samej diecie podczas leczenia
[patrz też: chusteczki antybakteryjne, laboratorium pruszcz gdański, porozumienie rodzicielskie wzór ]
[hasła pokrewne: rezonans magnetyczny puławy, szczepienie dur brzuszny, makijaz permanentny cena ]
[przypisy: rezonans magnetyczny puławy, szczepienie dur brzuszny, makijaz permanentny cena ]