Hepatic Niemann-Pick C1 Jak 1 reguluje stężenie cholesterolu w żółci i jest celem ezetymibu ad 8

Skład soli żółciowych jest znacznie bardziej hydrofobowy u ludzi niż u myszy, ze znacznymi ilościami chenodeoksycholanu i deoksycholanu, soli dihydroksycholilowych, które są silnymi detergentami. W przeciwieństwie do tego, pula u myszy składa się w dużej mierze z hydrofilowych soli żółciowych, cholanu i murikolanu, a myszy są w stanie wydajnie rehydroksylować więcej hydrofobowych wtórnych BA, które są ponownie wchłonięte z jelita. Podczas gdy faza lipidowa błony kanałowej może być mniej ważna dla ochrony przed hydrofilowymi solami żółci obecnymi u myszy, ludzie mogli rozwinąć się, aby wyrażać wyższe poziomy wątrobowego NPC1L1, aby dokładnie kontrolować zawartość cholesterolu kanału i chronić przed uszkodzeniem wątroby i cholestazą. . Metody Stworzenie myszy L1-Tg. Pełnej długości cDNA NPC1L1 (nr dostępu GenBank AY436875) klonowano jak opisano wcześniej (10). W celu stworzenia myszy L1-Tg, miejsca KpnI i ClaI dodano do 5. i 3. końce odpowiednio cDNA NPC1L1. Ten cDNA został następnie wklonowany w miejsca restrykcyjne Hpal / ClaI konstruktu pLiv-11 (44) po stępieniu miejsca KpnI za pomocą polimerazy DNA T4. Konstrukt pLiv-11 został wybrany, ponieważ był używany wcześniej przez innych badaczy do kierowania ekspresji transgenu w wątrobie (34, 45). Ponieważ miejsce Sali w konstrukcie pLiv-11 nie może być użyte do uwolnienia kasety transgenu w wyniku obecności tego miejsca w cDNA NPC1L1, zostało zaprojektowane i zastąpione klastrem rzadkich miejsc restrykcyjnych (SrfI, PmeI, NotI, i PacI) przed klonowaniem cDNA. Kasetę transgenu obejmującą ludzki promotor apoE, cDNA NPC1L1 i ludzki region kontrolny wątrobowy apoE uwolniono z konstruktu przez trawienie NotI / SpeI. Po oczyszczeniu transgen został poddany mikroiniekcji do zapłodnionych zarodków myszy F1 B6D2 (Harlan) w Transgenic Mouse Core Facility Wake Forest University Health Sciences, a transgeniczne mysie linie L1-Tg20 i L1-Tg112 zostały ustalone przez wszczepienie zarodków z mikroiniekcją matki. Stwierdzono, że kaseta transgenu jest nienaruszona w tych liniach za pomocą skriningu PCR różnych regionów. Mendelskie dziedziczenie transgenu zostało potwierdzone przez 50% dodatnich potomstwa od każdego transgenicznego założyciela. Myszy Hemizygous dodatnich L1-Tg zawsze krzyżowano z myszami WT B6D2 F1 w celu wytworzenia hemizygotycznych myszy L1-Tg i myszy kontrolnych z miotu WT dla wszystkich eksperymentów. Wszystkie myszy trzymano w specjalnym obiekcie wolnym od patogenów w plastikowych klatkach w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22 ° C) z cyklem 12 godzin światła / 12 godzin ciemności. Myszy karmiono ad libitum pokarmem dla gryzoni opartym na zbożu, o ile nie podano inaczej i miał swobodny dostęp do wody. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. Opieki nad zwierzętami w Wake Forest University Health Sciences. Zbiór ludzkiej tkanki. Prawidłową tkankę wątrobową uzyskano od pacjentów skierowanych do Karolinska University Hospital Huddinge w celu chirurgicznej resekcji wątroby z powodu raka. Próbki wątroby zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze <70 ° C do wykorzystania w przyszłości. Badanie z ludzką tkanką wątrobową zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Człowieka w Karolinska Institute. Pisemną świadomą zgodę udzielili poszczególni pacjenci. Przygotowanie i analiza zachodnia homogenatów tkankowych i lizatów komórkowych. W sumie 50-100 mg próbki tkanki homogenizowano w 0,5 ml buforu do lizy (20 mM HEPES-HCl, pH 7,4; 5 mM MgCl2; mM EGTA; 10% glicerolu; 1% Nonidet P-40; 0,12% hemibursztynianu cholestylu; ester, mM fluorek fenylometylosulfonylu, 10 jig / ml aprotyniny, 10 jig / ml leupeptyny, 5 jig / ml pepstatyny A i mM DTT). W przypadku świeżych ludzkich hepatocytów (Cellzdirect Inc.) i Huh7, osad komórek zebrano w 400 .l buforu do lizy. Zarówno homogenaty tkankowe, jak i lizaty komórkowe przepuszczano 15 razy przez igłę o średnicy 22 °. Po odwirowaniu przy 1000 g przez 10 minut w 4 ° C, supernatant zebrano i solubilizowano przez wirowanie przez noc w 4 ° C. Białka lizowane poddawano immunoblottingowi, jak opisano poprzednio (10, 46) z poliklonalnym króliczym anty-ludzkim przeciwciałem NPC1L1 69B (uprzejmie dostarczonym przez JC Cohena i HH Hobbs, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, USA) i króliczego anty-szczurzego RAP surowica (21). Immunohistochemia. Zamrożone w acetonie fragmenty próbek wątroby poddano obróbce pod kątem immunohistochemii fluorescencyjnej z przeciwciałem Bsn4052 z ludzkim NPC1L1 (2) i mysim przeciwciałem monoklonalnym C219 z kanałową glikoproteiną P ABCB1, jak opisano wcześniej (10). Skrawki badano przy użyciu skaningowego mikroskopu skaningowego model 510 lub mikroskopu fluorescencyjnego Axioplan 2 (Zeiss). Pomiary stężenia lipidów w wątrobie, osoczu i żółci [podobne: bytovia hpu pl, zielone koktajle przepisy, dlaczego ziewanie jest zaraźliwe ] [hasła pokrewne: kamil juraszek, laboratorium pruszcz gdański, barszcz czerwony magdy gessler ] [hasła pokrewne: kamil juraszek, laboratorium pruszcz gdański, barszcz czerwony magdy gessler ]