Brodawka nerek jest niszą dla komórek macierzystych nerki dorosłych ad 11

W przypadku sekcji 5- m, półrękankę zawierającą brodawkę utrwalono 4% paraformaldehydem lub 10% formaliną. W pierwszym przypadku, po utrwaleniu nerkę inkubowano z 30% sacharozą w PBS, a następnie zamrożono w związku OCT Tissue-Tek (Sakura Finetek) z zawiesiną stałego CO2 w 2-metylobutanie. Gdy nerki utrwalono w 10% formalinie, przetworzono je w bloki parafiny standardowymi technikami. W przypadku 100-nanometrowych części pół nerki zawierającej brodawkę najpierw utrwalono metanolem w 20 ° C, a następnie zatopiono w bloku 3% agarozy. Skrawki uzyskano za pomocą wibratora 1000 Plus (Pelco). BrdU wykryto mysim monoklonalnym przeciwciałem monoklonalnym FITC sprzężonym z FITC przeciw BrdU (Roche) zgodnie z procedurą producenta, chyba że wskazano inaczej (patrz poniżej). W skrócie, skrawki inkubowano z 2 N HCl w 37 ° C przez godzinę, następnie buforowano 0,1 M boranem sodu, pH 8,5, a następnie inkubowano w PBS. Wszystkie nieznakowane przeciwciała pierwotne wykryto jak opisano wcześniej (13). Proliferacja komórek u szczurów. z BrdU w wieku 3 dni badano w skrawkach parafiny przez immunodetekcję monoklonalnym przeciwciałem przeciwko szczurzemu antygenowi Ki-67 (22). W skrócie, po odwoskowaniu sekcje inkubowano przez 45 minut w 95 ° C z DakoCytomation Target Retrieval Solution (DAKO). Po przepłukaniu PBS, skrawki inkubowano z przeciwciałem przeciwko Ki-67, a następnie z drugorzędowym przeciwciałem przeciwko myszy sprzężonym z rodaminą. Następnie skrawki inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej z 10 U / ml DNAzy I (Roche) w 25 mM Tris i 50% glicerolu, pH 7,6. Po przepłukaniu, sekcje ostatecznie inkubowano z przeciwciałem FLITC sprzężonym z fluoresceiną przeciw BrdU opisanemu powyżej. Wykrywanie apoptozy przeprowadzono w skrawkach parafinowych przez barwienie fragmentowanego DNA TUNEL za pomocą zestawu do wykrywania śmierci komórek In Situ TMR red (Roche) zgodnie z instrukcjami producenta. Sygnały fluorescencyjne wykryto za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i kamery cyfrowej RT Slider SPOT (Diagnostic Instruments Inc.). Skrawki oglądano również za pomocą laserowego mikroskopu konfokalnego Axiovert 100 (model LSM 410, Carl Zeiss Inc.). Wzbudzenie przeprowadzono za pomocą lasera argon-krypton wytwarzającego linie przy 488 nm dla próbki znakowanej fluorescencyjnie FITC i 568 nm dla próbki znakowanej rhaminą. Obrazy zebrano, jak wskazano w odpowiednich legendach figur, z sekcji optycznych o grubości lub 2 .m i analizowano za pomocą oprogramowania Zeiss LSM-PC. Ostateczne obrazy zostały przetworzone za pomocą oprogramowania Adobe Photoshop. Wstrzyknięcie nerkowe komórek brodawkowatych nerki. Komórki macierzyste nerki hodowane in vitro poddano trypsynizacji i znakowano zestawem do ogniw komórkowych PKH26 Red Fluorescent (Sigma-Aldrich) zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki następnie wysiewano w gęstości subkonfluentnej i po całonocnej hodowli badano próbkę komórek pod płynem
[hasła pokrewne: makijaz permanentny cena, chusteczki antybakteryjne, narodowy fundusz zdrowia sanatorium ]
[przypisy: barszcz czerwony magdy gessler, rezonans magnetyczny puławy, szczepienie dur brzuszny ]
[przypisy: barszcz czerwony magdy gessler, rezonans magnetyczny puławy, szczepienie dur brzuszny ]