Brodawka nerek jest niszą dla komórek macierzystych nerki dorosłych ad 10

Ponadto, zdolność nerki do odzyskania funkcji po długotrwałym niedokrwieniu może być spowodowana opornością brodawki na uszkodzenie niedokrwienne. Podobnie, podawanie związków nefrotoksycznych, takich jak chlorek rtęci, który indukuje przemijającą ostrą niewydolność nerek, jest związane z wyraźnymi zmianami morfologicznymi w brodawki nerkowej, ale te zmiany sugerują zwiększoną aktywność komórkową, a nie uszkodzenie komórek (45). Metody BrdU ładowanie szczurów i myszy. Aby uzyskać zwierzęta z komórkami utrzymującymi BrdU, 3-dniowym szczurom Sprague-Dawley i myszom CD podawano podskórnie 50 .g / g BrdU (Sigma-Aldrich) dwa razy dziennie przez 3,5 dnia. Następnie zwierzętom pozwolono rosnąć, a ich nerki zbierano począwszy od 2 miesiąca życia. Eutanazję osiągnięto dzięki narkozie CO2. Przejściowe niedokrwienie nerek. Szczury Sprague-Dawley o wadze około 300 g znieczulono ketaminą / ksylazyną i wykonano tylne nacięcie podżebiste po lewej stronie i wycięto tętnicę nerkową. Zastosowano niewielki zacisk naczyniowy do zamknięcia tętnicy nerkowej przez 45 minut, podczas gdy zwierzę trzymano w temperaturze 37 ° C za pomocą koca grzejnego. Po usunięciu zacisku ranę zszyto, a szczura ponownie umieszczono w klatce. U szczurów, u których zbadano proliferację komórkową po niedokrwieniu za pomocą BrdU, szczurom podano pojedynczą dawkę 100 mg / kg BrdU dootrzewnowo na godzinę przed uśmierceniem. Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez The Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Columbia. Izolacja komórek brodawkowatych nerki. W celu wyodrębnienia komórek brodawkowych nerki zebrano i trzymano w HBSS zawierającym 15 mM HEPES, penicylinę / streptomycynę i 0,35 g / l NaHCO3, pH 7,4, w temperaturze 4 ° C. Po usunięciu tłuszczu okołokronowego nerki podzielono wzdłuż osi przedniej-tylnej, upewniając się, że brodawki zostały pozostawione nietknięte i przyczepione do jednej z dwóch pół-nerek. Po izolacji brodawki tkankę rozdrabniano i trawiono 2 mg / ml kolagenazy I (Worthington), wstrząsając przy 175 obrotach na minutę w wytrząsarce o temperaturze 37 ° C. Następnie, za pomocą szpatułki, tkankę przepchano przez kolejne 106-. M i 20. M stalowe filtry (VWR). Zdyspergowane komórki następnie zebrano przez odwirowanie. Hodowlę komórkową. W hodowli tkankowej zebrane komórki zdyspergowano DMEM / Ham F12 (Invitrogen Corp.) zawierającym 10% FCS, 5% ekstraktu z zarodka kurczaka i 5% surowicy szczurzej (zarówno z USBiological), jak i 2 mM glutaminy, penicyliny, i streptomycyny. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie kultury utrzymywano w 37 ° C w atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza pokojowego. Gdy komórki hodowano w pożywkach pozbawionych surowicy, pożywki hodowlane składały się z DMEM / Ham F12, zawierającego glutaminę i antybiotyki plus 5 .g / ml insuliny, 5 .g / ml transferyny, 5 ng / ml selenianu sodu, 20 ng / ml deksametamonu 20 ng / ml l-tyroksyny (wszystkie z Sigma-Aldrich), 50 ng / ml bFGF, 100 ng / ml PDGF i 20 ng / ml EGF (wszystkie z R & D Systems). Komórki hodowano albo w plastikowych naczyniach, albo w naczyniach powleczonych 5. G / cm2 fibronektyny (BD). Po zastosowaniu dodano LIF (R & D Systems) w stężeniu 100 ng / ml. Poszczególne klony komórek otrzymano w sposób opisany (13). Cytometrii przepływowej. W przypadku cytometrii przepływowej komórek brodawkowatych nerek, brodawki nerkowe trawiono jak opisano powyżej i zebrane komórki zawieszono w PBS zawierającym 10 U / ml DNAzy I (Roche), 3% FCS i 1% surowicy osła. W 4 ° C komórki inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami i, w razie potrzeby, po odwirowaniu i przemywaniu, z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoroforeą. Przed cytometrią przepływową komórki przemyto i inkubowano z jodkiem propidyny (Molecular Probes). Do cytometrii przepływowej komórek z różnych regionów nerki, oprócz brodawki, wycięto kortę i rdzeń. Próbki tkanek ze wszystkich trzech regionów zostały strawione, a ich komórki zostały wyizolowane jak opisano powyżej dla komórek brodawkowatych. Zebrane komórki zawieszono w PBS zawierającym 10 U / ml DNAzy (Roche). Komórki następnie utrwalano w temperaturze 4 ° C przez 30 minut z 70% etanolem i poddawano obróbce w celu wykrycia BrdU z fluoresceiną anty-BrdU-FITC (Roche), jak wyszczególniono przez producenta. Dane zebrano za pomocą cytometru FACStarPlus (BD). W przypadku wszystkich analiz zebrano co najmniej 10 000 komórek. Bramkowanie skonstruowano w oparciu o kontrole negatywne, a kontrole kompensacyjne uwzględniono we wszystkich przeprowadzonych analizach. Procent i procent populacji zostały wygenerowane dla bramkowanych populacji z każdego eksperymentu przy użyciu oprogramowania CellQuest (BD). Immunodetekcja. Nerki wyizolowano i podzielono na przednią-tylną oś, uważając, aby brodawka pozostała w jednej z dwóch połówek nerki
[hasła pokrewne: bytovia hpu, bytovia hpu pl, dlaczego ziewanie jest zaraźliwe ]
[więcej w: bytovia hpu pl, kamil juraszek, laboratorium pruszcz gdański ]
[więcej w: bytovia hpu pl, kamil juraszek, laboratorium pruszcz gdański ]